2008, 24(5):433-438.
摘要:
通过对质粒提取过程进行分析，探讨质粒提取过程中的影响因素，分析影响质粒质量的因素，以及优化提取工艺流程，并建立质控标准来控制质粒提取过程中带来质量和数量损失，从而制备出高纯度的质粒DNA。温度诱导可以增加质粒DNA的产量，在大肠杆菌对数生长中期进行温度诱导，从37~43 ℃，每间隔1 ℃度进行诱导，结果表明经42 ℃诱导12 h，质粒DNA的产量可以增加66%以上，为降低成本，大规模生产重组质粒提供良好保障。另外对碱裂解粗提质粒的方法和流程进行改进，采取LiCl去除细胞碎片和杂蛋白；PEG8000沉淀质粒DNA从而去除经RNAase消化的RNA；之后利用少量的酚氯仿混合液去除蛋白质；不仅蛋白质，RNA去除干净，而且在实验时间安排上以及试剂使用量上进行控制，达到了贵重试剂使用量少，去除杂质干净的效果，更为后续的精提做好准备。利用凝胶层析，亲和层析，阴离子交换层析依次去除残余在质粒DNA中的蛋白质、RNA、非超螺旋DNA以及内毒素，达到了制备高纯度质粒DNA要求，并且达到了可以在动物实验中进行转染的质量要求。
