阿尔兹海默症（Alzheimer’ Disease,AD）是一种常见于中老年人的神经退行性疾病，目前随着社会的发展，AD 的发病率不断上升。由于其不可逆转的原因，AD 已经成为世界上最严重的疾病之一。据统计，全世界目前有近3 000 万人罹患AD，在未来20 年这个数字可能会再翻一倍 [1]。AD 发病通常会导致患者的认知和空间记忆能力下降、脑部炎症以及睡眠障碍等多方面的疾病，这涉及到神经细胞损伤、线粒体和糖脂代谢等功能障碍，最终导致神经系统的不可逆损伤 [2]。目前对于AD 的发病机制仍然没有确切的定论，较为流行的几种假说包括淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein,APP）异常水解形成的β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）导致的神经毒性，tau 微管蛋白的过度磷酸化引起的神经纤维缠结（Neurofibrillary Tangles,NFT），以及胆碱能神经递质假说等 [3,4]。氧化应激损伤是导致神经元凋亡的重要原因，这是因为Aβ 沉积所形成的不溶性斑块会导致自由基的大量生成，引起线粒体功能、糖脂代谢以及其他关键的生化反应障碍 [5-7]，最终导致神经元因供能不足等原因凋亡。因此，改善氧化应激损伤可能是改善AD 的重要研究方向。
越来越多的证据显示，多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）与大脑部分功能有着密切联系，如突触间神经递质的传递，作为细胞膜的组成成分等 [8]。一些研究表明，诸如二十二碳六烯酸为代表的PUFAs 能够很好的缓解AD 动物模型的症状，这可能与PUFAs 优良的抗氧化能力有关 [9]。另外，在一些队列研究中也显示，中老年人群食用富含PUFAs 的食品能够显著降低认知障碍风险，体现了PUFAs 潜在的神经保护功效 [10]。这些研究说明开发富含PUFAs 相关的产品可能是未来治疗AD 的重要研究方向。
美藤果（Plukenetia volubilis）是一种原产于秘鲁的大戟科植物，在2013 年被批准为新资源食品 [11]。作为一种油料作物，美藤果种子中富含油脂、蛋白质等多种对人体有益的成分。美藤果油是从美藤果仁中提取出的食用油，其组成多为ω-3、ω-6和ω-9 多不饱和脂肪酸，以及维生素E 等多种抗氧化营养成分 [12]。前期研究显示，美藤果油能够改善大鼠的氧化应激反应标志物，改善小鼠肠道菌群紊乱等 [13]，但目前对美藤果油治疗AD 的研究仍然较少。本研究旨在探讨美藤果油对Aβ25-35 诱导的AD模型细胞SH-SY5Y 的保护作用，以期开发新型缓解AD 的产品，并为其他相关的研究提供理论支持。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
美藤果油，普洱联众生物技术有限公司惠赠；人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y），武汉华尔纳生物科技有限公司（货号：SAc0350)；Aβ25-35，上海麦克林生化科技有限公司（货号：A800621，纯度：≥97%）；MEM/F12 基础培养基、非必需氨基酸（Nonessential Amino Acid,NEAA）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS），武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）、青链霉素（Penicillin-Streptomycin,P/S），赛默飞世尔科技有限公司；活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）检测试剂盒、丙二醛（Malonic Dialdehyde,MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）水平检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术研究所；CCK-8 细胞增殖检测试剂盒，白鲨生物公司。
Varioskan TM LUX 多功能酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TCS SP8 激光共聚焦荧光显微镜，德国Leica 公司；分析天平，上海精天电子仪器厂；细胞恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；BD FACSCalibur 流式细胞仪，碧迪医疗器械有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
SH-SY5Y 细胞培养于特定完全培养基中，培养箱条件为37 ℃、5% CO2。每天更换培养液直至细胞密度达到70%～80%，进行传代培养，选取处于对数生长期的细胞进行实验。
Aβ25-35 寡聚体制备参照文献 [14]的方法进行，稍作修改。精确称取1 mg Aβ25-35，加入1 mL 的超纯水，配制成 1 mg/mL 的质量浓度，置于细胞培养箱中培养72 h，聚集老化形成Aβ25-35 寡聚体，并储存于-80 ℃冰箱中备用。分别称取对应质量的美藤果油，加入150 μL 细胞级二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO），以完全培养基配制成0、5、10、20、40 μg/mL 的质量浓度，现配现用。参照表1 分组方案，每组设置六个复孔。
表1 分组方案与实验流程
Table 1 Grouping scheme and experimental procedure
注：—为正常培养。
1.2.2 CCK-8法测定细胞增殖率
Aβ25-35 寡聚体用完全培养基稀释至0、20、40、60、80、100 μg/L 的质量浓度，美藤果油依照1.2.1的方法配制，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中培养过夜，参照表1 分别加入100 μL 上述溶液，孵育24 h。按照试剂说明书配制CCK-8 工作液。孵育结束后，每孔吸去培养基并用预热的PBS 清洗两次，随后加入100 μL CCK-8 工作液，在细胞培养箱中孵育4 h 后，在450 nm 处测定各孔吸光度值。细胞增殖率参照如下公式计算：
式中：
D——细胞增殖率，%；
A0——只含有完全培养基和CCK-8 工作液的吸光度；
A1——含有药物溶液、细胞和CCK-8 工作液的吸光度；
A2——不含药物溶液，含有细胞和CCK-8 工作液的吸光度。
1.2.3 细胞ROS测定
按照ROS 试剂盒说明书，用MEM/F12 培养基稀释荧光探针DCFH-DA 工作液。孵育结束后，收集细胞沉淀，加入2 mL 稀释好的DCFH-DA 工作液，在细胞培养箱内孵育20 min。孵育结束后，加入MEM/F12 培养基洗涤三次，采用流式细胞术在激发波长488 nm，发射波长为525 nm 处测定荧光强度。
1.2.4 细胞氧化应激及蛋白含量测定
孵育结束后，吸去上清液，在每孔加入1 mL裂解液，裂解40 min，将所有液体用移液器吸出，得到细胞破碎液。依据试剂盒说明书测定细胞破碎液中MDA、SOD 含量。
1.2.5 细胞线粒体膜电位水平测定
细胞培养结束后，收集细胞悬液。依照试剂盒说明书，用JC-1 法测定细胞线粒体膜电位。采用流式细胞术在激发波长490 nm，发射波长为530 nm处检测JC-1 单体；在激发波长525 nm，发射波长590 nm 处检测JC-1 聚合物。
1.2.6 Western blot
依照试剂盒说明书进行蛋白浓度测定以及蛋白提取，用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白后将其转移至PVDF 膜上，并加入φ=5%的脱脂牛奶封闭处理1 h。用PBST 稀释一抗后，在4 ℃下孵育过夜。孵育结束后，用PBST 洗净并加入PBST 稀释的二抗，在室温下共同孵育90 min。孵育结束后用PBST 缓冲液洗净，用ECL 化学发光液与膜孵育1 min，在凝胶成像系统中成像。以β-actin 为内参，用Image J 软件对各个条带灰度值进行数值分析。
1.2.7 流式细胞术测定细胞凋亡率
使用Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒进行检测。在细胞沉淀中加入500 μL 1X Annexin V buffer 重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，在室温下避光孵育15 min，使用流式细胞术进行检测。
1.3 数据处理
使用Image J 软件对图片中荧光强度及条带灰度值进行分析，使用GraphPad Prism 8.0.2 进行统计分析，用单因素方差分析与Tukey 检验法进行组间比较。实验数据以平均值±标准差表示。与模型组比较：*P＜0.05，有差异；**P＜0.01，差异显著；***P＜0.001，差异极显著，与空白组比较：#P＜0.05，有差异，##P＜0.01，差异显著，###P＜0.001，差异极显著，所有实验均重复三次。
2 结果与分析
2.1 CCK-8测定各药物质量浓度对SH-SY5Y活力影响
采用CCK-8 法分别测定Aβ25-35 的造模质量浓度以及美藤果油的毒性评价。结果如图1 所示：在给予Aβ25-35 后，各组细胞活力均有一定程度的下降，其中在25 μg/L 的质量浓度下，细胞活力降至64.62%（P＜0.005），因此本研究采用25 μg/L 的质量浓度处理构建AD 细胞模型。图2 显示，各剂量组美藤果油以及DMSO 均不会对细胞活力产生不利影响（P＞0.05）。因此，本实验采用10、20、40 μg/mL的美藤果油处理细胞，研究美藤果油对AD 细胞的保护作用并分析是否具有质量浓度依赖性。
图1 不同质量浓度Aβ25-35 对SH-SY5Y 细胞活力的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of Aβ25-35 on the viability of SH-SY5Y cells
图2 不同质量浓度美藤果油和DMSO 对SH-SY5Y细胞活力的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of Sacha inchi oil and DMSO on the viability of SH-SY5Y cells
2.2 美藤果油缓解SH-SY5Y氧化应激损伤
对各组细胞内ROS 含量采用流式细胞术分析，由图3 可知，与AD 组相比，各剂量组的ROS 荧光强度显著下降，并呈剂量依赖性。MDA与脂质过氧化程度相关，而SOD 是重要的抗氧化酶，因此采用上述指标来共同反映细胞氧化应激损伤程度。结果显示，AD 组的MDA 含量显著上升，SOD 酶活力下降，说明存在严重的氧化应激损伤，而经过美藤果油治疗后，20、40 μg/mL 剂量组MDA 含量水平分别降低了24.24%、42.73%，ROS 含量水平分别降低了15.34%、25.53%，同时SOD 的含量分别提高了20.81%、27.27%。上述结果说明美藤果油能够改善Aβ25-35 所致的SH-SY5Y氧化应激损伤。
图3 不同质量浓度美藤果油对SH-SY5Y 细胞氧化应激的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of Sacha inchi oil on oxidative stress in SH-SY5Y cells
2.3 美藤果油改善SH-SY5Y细胞凋亡
经美藤果油处理后，采用Annexin V-FITC/PI法以及JC-1 线粒体膜电位水平检测共同反映细胞凋亡情况。JC-1 荧光探针能够反映线粒体膜电位水平，当线粒体膜电位较高时，JC-1 进入线粒体基质形成JC-1 聚合物，而线粒体膜电位降低时则形成JC-1 单体，通过JC-1 聚合物与JC-1 单体含量来说明线粒体的去极化作用。各组线粒体膜电位水平如图4 所示，AD 组的线粒体膜电位下降，JC-1 聚合物水平下降，JC-1 单体水平上升。经过美藤果油治疗后，线粒体膜电位显著回升，提高了JC-1 聚合物水平，下调JC-1 单体水平，并呈现一定的剂量关系，这与细胞凋亡荧光强度（图5）结果相一致。结果显示，美藤果油能够通过回调线粒体膜电位来改善细胞凋亡。
图4 不同质量浓度美藤果油对Aβ25-35 诱导损伤SH-SY5Y细胞膜电位水平的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of Sacha inchi oil on Aβ25-35-induced damage to SH-SY5Y cell membrane potential levels
图5 不同质量浓度美藤果油对Aβ25-35 诱导损伤SH-SY5Y细胞凋亡的影响
Fig.5 Effect of different concentrations of Sacha inchi oil on Aβ25-35-induced apoptosis in damaged SH-SY5Y cells
2.4 美藤果油改善SH-SY5Y细胞氧化应激与凋亡蛋白表达水平
各剂量组细胞凋亡蛋白表达水平如图6 所示。经过25 μg/L Aβ25-35 诱导后，细胞内Bax 蛋白表达显著上升，Nrf-2、HO-1、Bcl-2 蛋白表达显著下降，这表明细胞氧化应激损伤严重，凋亡蛋白大量表达。在经过20、40 μg/mL 美藤果油剂量组预处理后，下调了Bax 蛋白表达，并显著提高了Nrf-2、HO-1、Bcl-2 蛋白表达。这些结果说明，美藤果油通过调节Nrf-2/HO-1 抗氧化通路，改善氧化应激损伤，并调节凋亡相关蛋白表达来保护细胞。
图6 不同质量浓度美藤果油对Aβ25-35 诱导损伤SH-SY5Y细胞氧化应激与凋亡蛋白表达的影响
Fig.6 Effect of different concentrations of Sacha inchi oil on the expression of oxidative stress and apoptotic protein in SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35 damage
3 讨论
阿尔兹海默症已经成为全球最严峻的公共健康威胁之一，在用药上仍然缺乏特效药进行针对治疗。目前，临床上常用盐酸多奈哌齐片结合中草药复方来改善AD 患者的乙酰胆碱浓度水平 [15,16]，但由于AD 高发、致死且无法逆转的特性，这些治疗方案仅对早期AD 患者改善相应的临床症状有一定的疗效。因此，从预防的角度来减缓AD 发病的几率可能是重要的治疗方向。本研究通过证明美藤果油能够缓解氧化应激损伤来改善Aβ25-35 诱导的AD 细胞模型SH-SY5Y，其机制可能是通过提高Nrf-2/HO-1抗氧化通路、下调凋亡相关蛋白表达逆转细胞凋亡，从而改善AD 症状。
大量研究表明，神经元的损伤与氧化应激有着密切联系，自由基通过能够诱导Aβ 的沉积并进一步促进自由基的生成，加速AD 的发病病程 [17]。牛冬冬等 [18] 研究发现少突胶质样细胞条件培养液能通过调节Sirt1/PGC-1α 通路来改善氧化应激，并显著提高SH-SY5Y 细胞活力，降低氧化应激水平并提高线粒体膜电位。本研究分析了美藤果油对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y 细胞的保护作用与抗氧化活性的关系。结果表明，采用25 μg/L 的Aβ25-35 处理SH-SY5Y 细胞24 h 后，细胞内MDA 含量水平提高，ROS 荧光强度上升，SOD 酶活力水平降低，而经过美藤果油预处理后，显著降低了细胞内MDA 和ROS 含量水平，并提高了SOD 酶活力水平，这些结果说明美藤果油能够缓解Aβ25-35 诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤。
线粒体膜电位下降是细胞凋亡的早期症状之一 [19]。线粒体作为细胞能量的主要供应场所，线粒体膜电位不仅关系到ATP 合成，而且在清除失活线粒体、维持其余线粒体活力方面起着重要作用 [20]。凋亡相关蛋白Bcl 家族与氧化还原调节因子Nrf-2通路已被证明同线粒体膜通透性密切相关 [21,22]，当细胞受到刺激时，Bcl 家族蛋白结构被破坏，并大量分泌促凋亡蛋白Bax 聚集到线粒体膜上，导致线粒体膜通透性转换孔通道过度开放引起氧化应激损伤，使得Nrf-2/HO-1 通路促分泌抗氧化因子的水平下降，进一步导致细胞氧化应激损伤并最终诱导细胞凋亡。本研究结果显示，AD 组细胞中的线粒体膜电位显著下降，促凋亡蛋白Bax 表达上升，抗凋亡蛋白Bcl-2、抗氧化信号通路Nrf-2/HO-1表达下降，这与Jo 等 [23] 的研究结果相同。在给予美藤果油治疗后，各剂量组的线粒体膜电位显著上调，下调了促凋亡蛋白Bax 表达，并提高了抗凋亡蛋白Bcl-2、抗氧化信号通路Nrf-2/HO-1 的表达。这些结果说明美藤果油可能通过调节Bcl 家族蛋白表达，提高抗氧化信号通路Nrf-2/HO-1 改善细胞凋亡，达到预防AD 的目的。
近年来，膳食调节改善大脑健康已成为研究的热点，诸如地中海饮食等膳食模式已经证明对AD能够起到一定的改善作用，一项基于人群的大型研究证明了地中海饮食对大脑的长期益处，其中的重要原因则体现在所摄入的坚果、鱼类等食物中富含的PUFAs [24,25]。美藤果油作为一种优质的食用油原料，具有成熟周期短、单位面积产量高等优点 [26]，这使得美藤果油具有极大的开发潜力，在日常饮食中有更好的推广性。因此通过开发美藤果油，能够进一步拓展目前食用油市场，在保健食品和医药领域具有良好的应用和发展前景。
4 结论
本研究通过Aβ25-35 诱导的AD 细胞模型，加入不同浓度的美藤果油来观察其对AD 细胞模型损伤的缓解作用，通过CCK-8 实验可知各剂量组美藤果油不会抑制细胞增殖，并采用25 μg/L 的质量浓度构建AD 细胞模型。通过对比AD 组，美藤果油各剂量组有效改善了细胞氧化应激损伤，并通过研究细胞凋亡情况、线粒体膜电位，发现美藤果油能够逆转AD细胞凋亡，这与改善凋亡相关蛋白表达情况相一致。本研究为美藤果油改善AD 提供了可行性，后续结合改善氧化应激与凋亡这一研究方向，能够通过体内实验进一步深入研究美藤果油改善AD 的机制，为发掘美藤果油产品功效开发提供理论基础。
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