铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）属于兰科石斛属植物的新鲜或干燥茎，是我国传统名贵的中草药，因其表皮为铁绿色而出名，《神农本草经》将其列为上品，素有“药中黄金”、“救命仙草”之美誉，其含有的化学成分有多糖、石斛碱、氨基酸等，药理作用有增强免疫力、抗氧化、改善胃肠功能等[1]。随着人工种植技术的突破，铁皮石斛产量不断增加，近年来主要通过复配调配和发酵两种途径进行利用和开发[2]。发酵产品不仅能保留原料的活性成分、消除抗营养因素、改善生物利用率[3]，还符合消费者追求绿色健康食品的理念。因此，探究发酵对铁皮石斛的影响对提高铁皮石斛的经济效益及保健效益具有重要意义。
研究表明，乳酸菌发酵可以提高食品的营养价值、品质、安全、保藏性以及改善食品的风味[4-6]。例如，任运红等[7]研究发现使用产乳酸芽孢杆菌DU-106 和酿酒酵母菌171 发酵铁皮石斛酒，可促进铁皮石斛中有益物质的溶出率，提高发酵酒的营养价值；舒旭晨等[8]研究发现使用酵母菌和乳酸菌发酵铁皮石斛鲜条，得到具有良好抗氧化活性的石斛酵素；Xu 等[9]研究发现以铁皮石斛和香蕉为原料进行混菌发酵，发酵后的复合果汁的品质、抗氧化能力和贮藏稳定性均有提高。目前铁皮石斛多采用酵母菌和乳酸菌发酵或添加其他辅料共发酵，而采用混合乳酸菌发酵铁皮石斛汁并研究其功能活性物质及风味成分的研究鲜有报道。
随着人们对健康的认识和关注度的增加，社会对食品的营养和功能提出了更高的要求。目前铁皮石斛深加工产品和开发力度还不是很充分。试验前期在对比单菌和混菌发酵基础上，选择铁皮石斛汁中活菌数最高、抗氧化能力最强[10]的发酵菌种，即嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，La）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，Lp）混合发酵，探讨铁皮石斛汁中功能活性物质与风味成分的变化，为铁皮石斛产品研发提供新的思路和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
江西省龙虎山大棚人工种植的一年生新鲜铁皮石斛茎，江西轩斛生物科技有限公司；副干酪乳杆菌菌粉（JLPF-176）、嗜酸乳杆菌菌粉（JYLA-191），山东中科嘉亿生物工程有限公司；柠檬酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、乙酸，均为分析纯，北京索莱宝科技有限公司；甲醇，色谱纯，美国Sigma 公司；甲酸，色谱纯，中国上海阿拉丁有限责任公司。
1.2 仪器与设备
N-1100 型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；UPLC-ESI-QTOF-MS/MS、7890A-7000 型气相色谱-质谱仪、Agilent 1260 HPLC 系统，美国Agilent；L-8900型氨基酸分析仪，日本HITACHI 公司；JS-THERMO型多功能酶标仪，美国Thermo 公司；TU-1810DAP型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TGL216G 型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；YXQ-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZQTY-70E 型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；SW-CJ 型双人净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 铁皮石斛汁的制备
将新鲜铁皮石斛茎清洗晾干，切成2～3 cm 段，70 ℃水浴热烫5 min，按料水比1:10（m/V）进行打浆，用四层纱布进行过滤，取100 mL 滤汁采用90 ℃保持5 min 进行杀菌处理，得到铁皮石斛汁（Dendrobium officinale Juices，DOJ），于4 800 r/min 离心10 min，取上清液进行测定。
1.3.2 发酵铁皮石斛汁的制备
取La 和Lp 的冻干菌粉分别添加到生理盐水1:100（m/V），置于37 ℃水浴锅中活化20 min，活化后La 和Lp 的菌数目均为1.0×108 CFU/mL，参考黄庆等[10]的发酵方法，等比例接种2%（V/V）的La 和Lp的活化菌液于100 mL 铁皮石斛汁中，于37 ℃下恒温发酵24 h，发酵转速150 r/min，得到发酵铁皮石斛汁（Fermented Dendrobium officinale Juices，FDOJ），于4 800 r/min 离心10 min，取上清液进行测定。
1.3.3 活性物质的测定
1.3.3.1 多糖含量
参考《中华人民共和国药典》第一部（2020 年版）测定多糖含量[11]。
1.3.3.2 多糖分子量
样品处理：用体积分数为φ=95%乙醇和100 mL上清液以4:1（V/V）进行沉淀，静置过夜，于4 800 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用去离子水复溶，用α-淀粉酶除淀粉，sevage 法脱蛋白后旋蒸浓缩，冻干得多糖样品。采用Yang 等[12]的方法，通过测定得到的标准曲线方程为y=-0.182x+1.410 5，R2=0.999 7。
1.3.3.3 乙酸乙酯萃取成分
采用Dong 等[13]的方法，略有改动。样品处理：20 mL 上清液用乙酸乙酯以1:1（V/V）反复萃取3 次，合并乙酸乙酯相，蒸发浓缩至粉末。将干燥后的提取物重新复溶于1 mL 色谱级甲醇溶液中，经0.22 μm 的有机相滤膜过滤。
液相条件：梯度洗脱程序为5%～5%，0～1.5 min B；5%～35%，1.5～26 min B；35%～60%，26～33 min B；60%～100%，33～38 min B；100%～100%，38～41 min B；100%～5%，41～43 min B；5%～5%，43～45 min B。紫外色谱吸收波长设置为245 nm、280 nm、334 nm。
1.3.4 风味成分的测定
1.3.4.1 挥发性成分
采用Yang 等[14]的方法，略有改动。样品处理：称取5 g 样品于20 mL 进样瓶中，在80 ℃下平衡30 min，采用老化处理过的萃取头顶空吸附30 min，随后开始解吸。
GC-MS 测定条件：HP-5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min 后以8 ℃/min的速度升温到70 ℃，保持4 min，再以4 ℃/min的速度升温到145 ℃，以10 ℃/min的速度升温到220 ℃，保持3 min；不分流进样，进样口温度250 ℃；载气为He，流量为1.0 mL/min；碰撞气为N2，流量1.5 mL/min；淬灭气为He，流量2.25 mL/min；电子轰击源（EI）：70 eV；离子源温度280 ℃；接口温度280 ℃。
1.3.4.2 游离氨基酸
采用Chen 等[15]的方法，略有改动。用体积分数为1%的三氯乙酸将2 mL 上清液稀释10 倍，于4 ℃条件下10 000 r/min 离心10 min，取上清液再用0.02 mol/L 的盐酸溶液1:1（V/V）进行稀释混匀，再经0.22 μm 水相滤膜过滤后供氨基酸自动分析仪测试。
1.3.4.3 有机酸
采用Yang 等[14]的方法，略有改动。样品处理：取2 mL上清液经0.22 μm水相滤膜过滤供高效液相色谱仪测试。色谱条件：BIO-RAD Aminex® HPX-87H离子交换色谱柱C18（5 μm，250 mm×7.8 mm）；流动相：6 mmol/L 的稀硫酸；检测器：紫外检测器，波长：210 nm；流速0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；外标法定量。
1.4 数据分析
试验平行测定3 次，数据采用平均值±标准偏差表示。使用IBM SPSS Statistics 25 软件处理数据，P＜0.05 为显著差异，P＜0.01 为极显著差异。使用Origin 9 软件制图。
2 结果与分析
2.1 多糖含量分析
多糖是铁皮石斛重要的活性物质之一，铁皮石斛多糖能起到抗氧化、调节免疫、抗糖尿病等功能[1]。发酵前后铁皮石斛汁中多糖含量变化如图1 所示，DOJ 中多糖含量为3.88 mg/mL，FDOJ 中多糖含量为3.03 mg/mL，铁皮石斛汁经发酵后多糖含量极显著降低21.91%（P＜0.01）。王丹等[16]研究报道植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵铁皮石斛多糖含量明显下降，与本研究结果一致。发酵铁皮石斛汁中多糖含量降低可能是因为乳酸菌通过碳水化合物活性酶利用多糖来维持乳酸菌的生理活动[17]。
图1 DOJ 和FDOJ 的多糖含量
Fig.1 Polysaccharide content of DOJ and FDOJ
注：DOJ 表示铁皮石斛汁，FDOJ 表示发酵铁皮石斛汁，后同；“**”表示DOJ 与FDOJ 的多糖平均值含量差异极显著（P＜0.01），图3、4 同。
2.2 多糖分子量分析
结果如表1 所示，DOJ 有3 个洗脱峰，而FDOJ有4 个洗脱峰，多糖的平均分子量由发酵前的184.40 ku 减小至发酵后的91.27 ku。多糖的平均分子量减小的原因可能是乳酸菌在发酵过程中产生了相应的酶降解了多糖[17]，这与王丹等[18]研究的结果一致。分子量是研究多糖结构与活性的重要参数之一，多糖的分子量越小意味着体积也越小，体积小的多糖容易穿透细胞膜，有利于多糖发挥出抗氧化和降血糖[18]等活性。结果表明，乳酸菌能有效地利用铁皮石斛汁中多糖，降低其分子量，提高铁皮石斛汁中多糖潜在的活性。
表1 DOJ 和FDOJ 的多糖分子量
Table 1 The molecular weight of polysaccharides of DOJ and FDOJ
注：DOJ 为铁皮石斛汁，FDOJ 为发酵铁皮石斛汁，后同。
2.3 乙酸乙酯萃取成分分析
根据负离子模式下各色谱峰的保留时间、紫外特征、分子和离子峰及主要碎片峰信息，结合文献、Mass Bank 数据库收录的天然产物对化合物进行鉴定[19]。鉴定结果如表2 所示，发酵前后铁皮石斛汁中乙酸乙酯萃取成分共鉴定出25 种化合物，其中相同化合物11种，差异化合物14 种。
表2 DOJ 和FDOJ 乙酸乙酯萃取成分
Table 2 The ethyl acetate extracted components of DOJ and FDOJ
从表2 可知，DOJ 中鉴定出20 种化合物，包括有机酸6 种、羟基苯甲酸2 种、羟基肉桂酸3 种、类黄酮7 种、其他2 种；FDOJ 中鉴定出16 种，包括有机酸4 种、羟基苯甲酸3 种、羟基肉桂酸2 种、类黄酮5 种、其他2 种。发酵前后铁皮石斛汁中有机酸、羟基肉桂酸和类黄酮物质较发酵前分别减少2 种、1种和2 种，羟基苯甲酸较发酵前增加1 种。表明乳酸菌发酵能够产生一些中间产物或将原料中的物质进行转换[20]，使铁皮石斛汁的活性成分发生变化，例如，发酵铁皮石斛汁中的没食子酸，它是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等[21]活性的新成分。
2.4 挥发性成分分析
DOJ 和FDOJ 的挥发性成分如表3 所示，发酵前后铁皮石斛汁中共检测出41 种挥发性成分，其中发酵前后铁皮石斛汁中相同挥发性成分6 种，差异挥发性成分35 种。
表3 DOJ 和FDOJ 的挥发性成分
Table 3 Volatile components of DOJ and FDOJ
续表3
注：“-”代表未检出。
从表3 可知，DOJ 中检测出21 种挥发性成分，包括芳香烃1 种、酚类与醇类2 种、吡喃与呋喃1 种、烯烃8 种、醛类与酮类4 种、螺环类1 种、酯类1 种、酸类3 种，其中(+)-柠檬烯（40.59%）是DOJ 中主要挥发性成分；FDOJ 中检测出26 种挥发性成分，包括酚类与醇类9 种、吡喃与呋喃1 种、烯烃5 种、醛类与酮类9 种、螺环类1 种、酯类1 种，其中芳樟醇（42.55%）是FDOJ 中主要挥发性成分。发酵后铁皮石斛汁中酚类与醇类、醛类与酮类物质较发酵前分别增加7 种和5 种，烯烃物质较发酵前减少3 种。表明铁皮石斛汁在发酵前后的风味成分有明显变化，与熊涛[22]等研究报道有相似的结果。
根据化学结构分类，如图2a 所示，发酵前芳香烃、酚类与醇类、吡喃与呋喃、烯烃、醛类与酮类、螺环类、酯类、酸类物质相对含量分别为0.77%、3.96%、3.34%、65.16%、7.04%、0.72%、10.30%、8.70%，发酵后酚类与醇类、吡喃与呋喃、烯烃、醛类与酮类、螺环类、酯类物质相对含量分别为57.44%、1.35%、24.46%、10.11%、1.60%、5.04%。与发酵前相比，发酵后烯烃物质相对含量减少，酚类与醇类物质相对含量增多，未检出芳香烃和酸类物质，说明铁皮石斛汁经乳酸菌发酵后烯烃类物质转化为酚类与醇类香气物质[23]。根据香气描述分类，如图2b 所示，发酵前花香、水果香、其他香气物质相对含量分别为0.77%、50.07%、5.04%%，发酵后花香、木香、水果香、茶香、其他香气物质相对含量分别为52.41%、1.5%、27.5%、0.47%、1.42%。与发酵前相比，发酵后水果香气物质相对含量减少，花香香气物质相对含量增多，检出木香和茶香香气物质，牛佳佳等[24]研究报道乳酸菌发酵后挥发性物质的种类和含量增加，产生大量的高级醇，使发酵汁具有独特的风味，与本研究结果一致。
图2 DOJ 和FDOJ 挥发性成分种类（a）和香气类型（b）分布
Fig.2 Volatile component species (a) and aroma types (b)distribution of DOJ and FDOJ
2.5 游离氨基酸分析
铁皮石斛汁发酵前后游离氨基酸的种类和含量变化如图3 所示，DOJ 中检测出9 种游离氨基酸，FDOJ中检测出15 种游离氨基酸，发酵后游离氨基酸种类较发酵前增加6 种，分别为丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）。发酵铁皮石斛汁中检测出6 种人体必需氨基酸，比发酵前多2 种，分别为Phe 和Ile。氨基酸总含量由发酵前的1.48 mmol/L 增加到发酵后的5.85 mmol/L，其中谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）的含量分别极显著升高（P＜0.01），天冬氨酸（Asp）的含量极显著降低（P＜0.01）。氨基酸种类和含量变化的原因可能是乳酸菌通过内源性蛋白酶水解蛋白质，以及乳酸菌利用氨基酸生物转化成其他种类的氨基酸[31]。氨基酸不仅是营养成分，也是呈味物质。例如，Lys 和Arg 能够预防疾病和增强人体免疫力[32]，Asp、Gly、Glu、Ala、Arg 能赋予发酵汁甜味和鲜味[33]。综上，乳酸菌发酵可增加铁皮石斛汁中必需氨基酸和呈味氨基酸的种类与含量，赋予铁皮石斛汁良好的营养和风味。
图3 DOJ 和FDOJ 的游离氨基酸种类与含量
Fig.3 Free amino acid species and content of DOJ and FDOJ
注：横坐标从左往右氨基酸英文缩写依次表示赖氨酸（Lys）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）、天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）；横坐标从左往右数，前6 个氨基酸为必需氨基酸。
2.6 有机酸分析
铁皮石斛汁发酵前后有机酸的种类和含量变化如图4 所示，总共检测出5 种有机酸，在DOJ 中检测出3 种有机酸，在FDOJ 中检测出4 种有机酸，柠檬酸在FDOJ 中未检出，乳酸和乙酸仅在FDOJ 中检出。有机酸总含量由发酵前的1 671.90 mg/L 升高至发酵后的2 045.50 mg/L，其中发酵后乳酸含量高达1 556.70 mg/L，占有机酸总含量的76.11%；发酵后苹果酸和琥珀酸的含量极显著降低83.43%和65.89%（P＜0.01），含量分别为128.70 mg/L 和261.90 mg/L，可能是苹果酸在三羧酸循环中被转化成了乳酸，琥珀酸在碳代谢中被丙酮酸氧化成氢离子和乙酸[34]，这也是发酵后检测出乙酸的原因之一。乳酸产生的另外一个原因可能是葡萄糖经过糖酵解途径生成丙酮酸，在乳酸脱氢酶的作用下被还原成乳酸[34]，表明乳酸菌发酵能够增加铁皮石斛汁有机酸的种类和含量。不同的有机酸对食品风味的贡献不同，杨舒雅[35]研究报道微量的乙酸能够丰富食品的口感，乳酸具有柔润的口感，苹果酸带有水果的香气，但具有涩味和生青味，柠檬酸口感清冽，而琥珀酸带有点苦味。综上，发酵铁皮石斛汁含有大量的乳酸、微量的乙酸、少量的苹果酸和琥珀酸，乳酸菌发酵赋予铁皮石斛汁柔润的口感。
图4 DOJ 和FDOJ 的有机酸含量
Fig.4 Organic acid content of DOJ and FDOJ
3 结论
利用嗜酸乳杆菌与副干酪乳杆菌混合发酵铁皮石斛汁，探究乳酸菌发酵对铁皮石斛汁的影响。结果表明，乳酸菌发酵使石斛汁中多糖平均分子量减小，新产生的较小分子量多糖能够更好的吸收，增强多糖的潜在功能活性；产生有助于提高石斛汁的新功能活性物质，如具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的没食子酸活性成分。发酵后烯烃物质种类和相对含量均降低，酚类和醇类物质种类和相对含量均增加；同时必需氨基酸和呈味氨基酸的种类和含量均增加；有机酸种类增加，乳酸含量占有机酸总含量的76.11%，苹果酸和琥珀酸含量显著降低。这些成分的变化共同影响了铁皮石斛汁的风味，赋予了铁皮石斛汁花香香气、鲜甜的风味及柔润的口感。总体而言，嗜酸乳杆菌与副干酪乳杆菌混合发酵的铁皮石斛汁，在功能成分以及风味方面表现出一定的改善与提高，为铁皮石斛益生菌发酵产品的开发提供了可靠的理论依据。
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