紫米甜酒酿酸甜可口、别有风味，且富含花色苷、酚类、B族维生素等生物活性物质，具有益气生津、抗氧化、抗炎等保健功效，深受广大老百姓的喜爱[1-3]。紫米甜酒酿常温保质期短，需要通过杀菌以延长保质期，但不同的杀菌工艺会导致甜酒酿的风味成分发生不同程度变化。市售甜酒酿多是采用加热杀菌工艺，有研究报道，加热处理的方式可能会分解样品中的某些热敏性香气成分、造成小分子物质逸散以及生成不良味道[4]，从而影响甜酒酿的风味和口感。目前关于甜酒酿的研究主要集中在甜酒曲的优化筛选[5,6]，发酵工艺的优化等方面[7,8]，有关杀菌方式对紫米甜酒酿香气成分的影响鲜见报道。明确不同杀菌方式对甜酒酿香气和风味的影响，有利于探索适宜的杀菌保藏方法，在保证货架期的前提下，最大化保持紫米甜酒酿的风味品质。
电子鼻是90年代发展起来的一种基于模拟人类嗅觉系统的挥发性成分分析仪器，具有操作简单、快速无损，重复性好的特点，可以对不同样品气味轮廓的细微差异进行区分，但其无法定性定量分析某一种挥发性成分[9]。顶空气相色谱-离子迁移色谱（ Headspace gas Chromatograph-Ion Mobility Spectrometer，HS-GC-IMS）是基于气相保留时间和离子迁移时间的差异，来区分挥发性化合物的新型分析技术，具有前处理简单，香气无需浓缩和富集，灵敏度高，可检测痕量挥发性物质，分析速度快的特点[10]。
本研究结合采用电子鼻、HS-GC-IMS两种风味分析技术对不同杀菌处理（未杀菌对照、热杀菌、辐照杀菌、超高压杀菌）的紫米甜酒酿挥发性风味成分进行全面检测分析，探究不同杀菌方式对风味成分变化的影响规律，为以期为甜酒酿杀菌方式的选择提供参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫米（糙米），广东云浮市新兴微丰农业科技有限公司；根霉甜酒种，广东省肇庆市高要区粤桂酒饼菌种厂；食品级尼龙氯化聚丙烯复合材质（PA+CPP）塑料袋，喜之龙包装有限公司。
1.2 仪器与设备
电子鼻，德国Airsense公司；FlavourSpec®风味分析仪，德国G.A.S公司；800 MPa双容器食品超高压装置，包头文天科技有限责任公司；IS10/20型电子直线加速器，同方威视技术股份有限公司；真空包装机，东莞市青叶包装机械有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 紫米甜酒酿的酿造及杀菌流程
工艺流程[11]：
紫米→清洗→蒸煮→冷却→接种酒曲→拌匀搭窝→糖化发酵至终点→包装→杀菌→成品
1.3.2 杀菌方法
将甜酒酿混匀，分装于塑料袋中每袋100 g，真空包装后，按照前期优化的杀菌工艺，进行相应的杀菌处理。热杀菌：100 ℃加热处理20 min；超高压杀菌：600 MPa保压20 min；辐照杀菌：辐照剂量9 kGy。上述杀菌样品经理化及微生物指标检测，均达到软罐头国家标准。
1.3.3 电子鼻检测
PEN3型电子鼻由10种金属氧化物气体传感器阵列组成，如表1所示。准确称取10 g甜酒酿样品于40 mL顶空瓶中，40 ℃水浴密封静置30 min，随后插入电子鼻探头吸取顶端气体，测定挥发性物质。电子鼻参数[12]：采样间隔1 s，冲洗时间120 s，调零时间10 s，预采样时间5 s，检测时间120 s，载气流速、进样流速300 mL/min，每种样品重复测定6次。检测时传感器于107 s后趋于平稳，因此选取108 s时的响应值进行分析。
表1 PEN3电子鼻传感器敏感物质
Table 1 Sensitive substances of PEN3 electronic nose sensor
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1.3.4 HS-GC-IMS分析
参考Li Siying等[13]的方法并稍作修改。精密称取1 g样品置于20 mL顶空瓶中，60 ℃孵化20 min，顶空进样，进样量100 μL，不分流。
GC条件：色谱柱类型为WAX，长15 m，内径0.53 mm，膜厚1 μm，柱温60 ℃，载气为N2；载气流速，0～2 min，保持2 mL/min；2～10 min，从2 mL/min上升至10 mL/min；10～20 min，从10 mL/min上升至100 mL/min；20～40 min，保持100 mL/min。
IMS条件：漂移管的温度为45 ℃；漂移气为N 2；漂移气流速为150 mL/min。
1.3.5 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）
参考文献[14]，引入参数ROAV，评价各化学物对紫米甜酒酿风味的贡献，设定对样品风味贡献最大化合物：ROAVmax=100，其他化合物计算公式如下：
式中：Ci、Ti分别为各化合物的相对百分含量和对应的感觉阈值；Cmax、Tmax分别为对样品风味贡献最大组分的相对百分含量和感觉阈值。
1.4 数据分析
使用Excel 2019统计数据；使用SPSS 26.0进行数据的显著性分析；使用软件Winmuster进行电子鼻数据的载荷分析和LDA分析；使用GC-IMS仪器配套的软件LAV（labo-ratory analytical viewer）及4款插件Reporter、GalleryPlot、Dynamic PCA、Nearest Neighbor对样品挥发性化合物进行分析。
2 结果与分析
2.1 电子鼻分析不同杀菌处理紫米甜酒酿中的挥发性成分
2.1.1 传感器响应值变化分析
电子鼻传感器对4组样品的挥发性成分的响应信号如图1，可知，10种传感器对样品挥发性成分的响应程度不同，传感器R6（W1S）、R7（W1W）、R2（W5S）、R8（W2S）、R9（W2W）的响应信号普遍较强，响应值（G/G0）在25～60之间，它们分别对甲基类、硫化物、氮氧化合物、醇和醛酮、芳香成分比较敏感。其他传感器对样品的响应值较小，在0～5之间，表明电子鼻对样品中芳烃成分、苯类、芳香成分、氨类、氢类、短链烷烃、长链烷烃等物质的响应不敏感或该类物质含量较低，这与林俊帆[15]使用电子鼻对黑米米饭香气特性研究的结果基本一致。各组样品挥发性成分对传感器的敏感性大致相同，但响应值有所差异，R6显示样品经过加热和辐照杀菌，响应值显著下降（p＜0.05），R2、R7、R8分别显示样品经不同方式杀菌后，响应值显著上升（p＜0.05）。表明，经不同杀菌处理的样品存在挥发性成分的变化，而这些变化会影响紫米甜酒酿的整体风味。
图1 不同杀菌样品挥发性成分的传感器响应值
Fig.1 Sensor response value of volatile components of different sterilization samples
注：英文字母不同代表显著性差异p＜0.05。
2.1.2 传感器区分贡献率分析
在载荷分析图中，各个传感器的坐标位置可以准确表示其对样品区分贡献率的大小，与坐标原点距离越远，对样品区分贡献率就越大，反之则越小[16]。由图2可知，R2（W5S）、R8（W2S）、R6（W1S）、R7（W1W）距离原点较远，可知电子鼻区分不同杀菌甜酒酿的关键风味物质为氮氧化合物、醇和醛酮、甲基类、硫化物成分，这与传感器响应值分析结果相一致。
图2 不同杀菌样品电子鼻传感器载荷分析图
Fig.2 Load analysis diagram of electronic nose sensor for different sterilization samples
2.1.3 电子鼻线性判别分析LDA分析
LDA是有监督降维分析方法，目的是将数据降维成不存在信息交叉的新数据并依然基本保留样品的全部信息，使复杂的数据变得简单明了，LDA分析注重同类别数据在空间中的分布状态及彼此之间的距离，希望投影后数据组内方差小，而组间方差大，使不同类别的数据尽可能分开[17]，性质相似的样品在空间距离上会接近。
由图3可看出，第一主成分（PC1）的贡献率为63.60%，第二主成分（PC2）的贡献率为33.09%，PC1与PC2贡献率之和为96.69%，几乎反映了样品全部信息，且4组样品之间无交叉区域，区分明显，说明样品经过加热、辐照、超高压杀菌后风味成分发生改变。从各组样品之间的空间距离来看，超高压杀菌与未杀菌对照样品的距离最为接近，加热、辐照杀菌与未杀菌对照样品之间的距离较大，说明超高压杀菌样品的风味成分与对照组最为接近，超高压杀菌有利于保留样品原风味成分，这与徐增慧[18]等人研究高静压和热杀菌对桃汁香气成分的影响的结论一致，而加热、辐照杀菌样品风味成分与对照组相差较远，明显改变了甜酒酿原风味。
图3 不同杀菌样品电子鼻LDA分析图
Fig.3 LDA analysis diagram of electronic nose with different sterilization samples
但电子鼻检测分析仅能得到样品挥发性成分的整体轮廓，显示不同杀菌处理对紫米甜酒酿挥发性成分的响应信号有差异，但不能明确具体的成分，因此本研究进一步采用了HS-GC-IMS技术对样品的挥发物成分的具体物质构成进行测定与分析。
2.2 HS-GC-IMS分析不同杀菌处理紫米甜酒酿中的挥发性成分
2.2.1 紫米甜酒酿挥发性化合物的鉴定和分析
按照1.3.4中的条件通过GC×IMS Library Search软件内置数据库，对紫米甜酒酿挥发性化合物进行定性定量分析，在4种处理的紫米甜酒酿中鉴定出共同具有的挥发性物质42种（51个峰42种化合物见表2），其中10种醇类、16种酯类、5种醛类、5种酮类、4种酸类、1种烯烃类和1种烷烃类共7大类（统计见表3）。由表3可知，相对含量最高的是醇类，占总体挥发性成分的 62.03%～65.73%，其次是酯类（12.7%～13.93%）、酮类（9.36%～11.59%）、醛类（6.57%～7.26%）、酸类（3.02%～4.60%）、烷烃类（0.39%～0.56%）、烯烃类（0.10%～0.24%）。醇类和酯类是紫米甜酒酿中最重要的挥发性成分，这与苏佳佳等[7]、高莹莹等[19]的研究结果一致。不同杀菌方式使得紫米甜酒酿中挥发性风味成分相对含量发生不同程度的变化。
表2 紫米甜酒酿中鉴定出的挥发性化合物相对含量
Table 2 Relative content of volatile compounds identified in purple rice sweet wine
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表3 主要的挥发性有机化合物种类和相对含量
Table 3 types and relative contents of main volatile organic compounds
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醇类物质可以衬托酯香，促进香气协调，是样品的主要香气成分[20]。杀菌前后样品中相对含量最高的醇类物质均为乙醇、异戊醇、异丁醇，三者之和为51.43%～57.74%，超过挥发性成分相对含量总和一半，与苏佳佳[7]研究糙米甜酒酿香气成分的结果吻合。经热杀菌的样品中的醇类总体相对含量较未杀菌的样品增加了0.26%，可能是加热使得某些以糖苷健结合的醇类释放，以及氨基酸的去氨基和去碳酸基反应，从而使得醇类有所增加[21]。经过辐照杀菌样品醇类相对含量减少了3.45%，其中乙醇减少了2.54%，异戊醇减少了0.58%，说明辐照杀菌处理会降低样品中醇类的含量，与张满满等[22]研究的电子束辐照陈化小曲白酒的醇类变化趋势一致。样品经超高压处理醇类含量减少了1.55%，其中乙醇减少了0.86%，可能和醇类与酸类物质发生酯化反应形成酯类化合物有关[23]，醇类含量降低，可以减少酒精带来的刺激感，使酒体变的柔和。杀菌处理使得样品醇类物质相对含量发生不同程度的增加或减少。
酯类物质一般具有愉悦，怡人的果香。未杀菌样品中含量相对较高的酯类物质为乙酸乙酯（6.38%）、异丁酸乙酯（1.14%）、乙酸异戊酯（1.13%）。经过热杀菌，样品中酯类总体相对含量减少了1.31%，其中，异丁酸乙酯（0.77%），乙酸异戊酯（0.69%）相对含量均有不同程度的下降，加热处理使得部分酯类风味损失，可能原因是高温下酯类发生水解，这与吴琼[24]等对热杀菌处理的桑葚汁香气成分的酯类变化情况研究结果相吻合。经过辐照杀菌，不同酯类物质相对含量分别发生了不同程度的增加或减少，总体相对含量增加了0.53%，样品中主要酯类成分有乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸甲酯（相对含量＞1%），与谢彦岑[25]等研究的白酒辐照加速陈化实验酯类香气变化情况结果一致。经过超高压杀菌，酯类总体相对含量增加了0.55%，样品主要酯类成分有乙酸乙酯、异戊酸甲酯、乙酸丙酯、异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸乙酯（相对含量＞1%）。经过杀菌的样品与对照组相比，相对含量＞1%的酯类种类发生了变化，相对含量较高的酯类物质均为乙酸乙酯（5.86%～6.40%）。紫米甜酒酿经热杀菌处理酯类香气成分发生损失，经辐照、超高压杀菌处理酯类成分有不同程度的增加。
醛类风味阈值较低，风味特征明显[26,27]，紫米甜酒酿中共检测出5种，主要包括乙醛和丁醛，经过不同的杀菌处理，醛类总体相对含量都有不同程度下降。未杀菌样品中乙醛含量为5.25%，经过热处理下降到5.05%，经过辐照处理下降到4.82%，经过超高压处理下降到5.15%。未杀菌丁醛含量为1.24%，经过热处理下降到1.18%，经过辐照处理下降到0.97%，经过超高压处理下降到1.19%。
酮类也是样品香气的重要组成部分[28]，共检测出5种，主要包括丙酮、2-丁酮、2-戊酮（＞1%）。未杀菌样品酮类相对含量为9.47%，经热杀菌下降至9.36%，经过辐照杀菌增加至11.59%，经过超高压杀菌增加至9.94%。
样品中酸类物质共检测出4种，主要为乙酸和异丁酸，带有不愉快的气味，未杀菌样品酸类相对含量为3.02%，经过不同杀菌处理后，酸类成分都有不同程度的增加。
样品中检测出的烯烃类为柠檬烯，未杀菌样品百分含量为0.12%，经过热杀菌、超高压杀菌有不同程度增加，经辐照杀菌相对含量下降。检测到的烷烃类为丙烷，未杀菌样品百分含量为1.14%，经过不同杀菌处理，都有不同程度的下降。
2.2.2 气相色谱离子迁移谱（GC-IMS）差异对比图
图4 为不同杀菌处理的紫米甜酒酿挥发性成分GC-IMS差异对比图，差异对比图能够使各组样品间挥发性成分的差异可视化。图中纵坐标表示GC分离时化合物的保留时间，横坐标表示IMS分离时化合物相对于反应离子峰（RIP）的迁移时间，横坐标1.0处竖线表示RIP峰，RIP峰两侧的每个点代表一种挥发性成分。以未经杀菌处理的样品气味指纹谱图作为参比，其他不同杀菌处理样品的谱图扣除参比，若二者挥发性成分及含量一致，则扣减后的背景为白色，若对应成分的含量高于参比则显示红色，红色越深，差异越大；若对应成分含量低于参比则显示蓝色，蓝色越深，差异越大。由热杀菌的黑框区域可看出，有大量深蓝色点，很少的浅红色点，表明经过热杀菌样品中较多物质的量出现明显损失，含量下降。由辐照杀菌的红框区域可看出，出现大量的深蓝色点和红色点，且颜色较深，表明经辐照杀菌后，样品中一些物质含量出现明显减少，另一些明显增加，与对照组在挥发性成分量的构成上差异明显。由超高压灭菌的蓝框区域可看出，蓝点和红点的数量少，颜色较浅，白色区域相对较多，表明经超高压杀菌后挥发性成分的变化相对较小。显示三种杀菌方式中，超高压杀菌在保持紫米甜酒酿原有挥发性香气成分方面，优于热杀菌和辐照杀菌。与电子鼻检测数据的LDA分析结果相一致。
图4 不同杀菌方式处理的样品的GC-IMS差异对比图
Fig.4 Comparison of GC-IMS differences of samples treated by different sterilization methods
2.2.3 不同杀菌处理的样品的最近邻算法分析使用仪器软件自带的Nearest Neighbor最近邻算法分析插件对GC-IMS的测定结果进行分析，可以更加直观地判别区分不同杀菌样品之间的差异。最近邻算法是根据化合物的强度对样本进行快速比较，计算每两个样本的之间的欧几里得距离，检索最小距离来找到“最近邻”，底部颜色区域显示每个类的正态分布，欧几里得距离越近，相似度越高。分析结果见图5，超高压杀菌与未杀菌样品的欧几里得距离最近，相似度最高，其次是辐照杀菌，热杀菌距离最远。表明，经超高压杀菌处理后，紫米甜酒酿挥发性成分变化最小，能较好保持原样品的风味。紫米甜酒酿经辐照杀菌、热杀菌后挥发性成分变化明显。该结果与电子鼻检测的LDA分析，GC-IMS差异对比图谱分析相一致。
图5 不同杀菌方式处理的样品的最近邻算法距离图
Fig.5 Distance diagram of nearest neighbor algorithm for samples treated by different sterilization methods
2.2.4 紫米甜酒酿样品关键挥发性化合物分析
挥发性成分可以通过积累、协同、抑制和掩蔽等作用，使得香气复杂多变[29]，ROAV（相对气味活性值）可用于表征挥发性化合物对样品总体香气的贡献，ROAV≥1的成分为该样品关键性风味化合物，直接影响样品总体风味，ROAV值越大，对样品风味的贡献率越大，0.1≤ROAV＜1的成分为该样品修饰性风味化合物，修饰样品总体风味[30]。紫米甜酒酿中所有挥发性物质的阈值和香气描述参考相关文献[31-33]，根据式（1）计算得到得ROAV值。如表4可知，紫米甜酒酿中已定性挥发性化合物中ROAV≥0.1有18种化合物，对紫米甜酒酿的香气贡献较大。其中，4组样品中ROAV值大于1的风味化合物均有12种，共有的关键性风味化合物11种，分别为2-甲基丁酸乙酯、乙醛、异戊酸乙酯、异戊醇、丁醛、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯、戊醛、3-甲基丁酸、2-庚酮、己酸乙酯，赋予样品花果香和醇香，风味化合物种类相似，但贡献度差异较大。对不同杀菌样品ROAV值与对照样品相比差异大于1的化合物进行分析，热杀菌样品中有6种化合物ROAV值变化大于1,2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯ROAV值分别下降了30.61、9.07、3.96、2.35，异戊醇ROAV值下降了8.13，乙醛ROAV值下降了1.6，样品整体风味出现果香花香味、辛辣酒味减弱。辐照杀菌样品中有7种化合物ROAV值变化大于1，异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、异丁酸乙酯ROAV值分别下降了4.27、1.87、1.39，异戊醇ROAV值下降了8.18，乙醛、丁醛ROAV值下降了3.44、3.93，戊醛ROAV值上升了2.27，样品整体风味也出现果香花香味、辛辣酒味减弱，减弱程度较热杀菌样品低。超高压杀菌样品中异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯ROAV值分别下降了6.41、3.00、1.02，异戊醇ROAV下降了8.15，样品整体风味也出现果香花香味、辛辣酒味减弱，样品ROAV值变化大于1的风味化合物种类为3种，少于加热、辐照杀菌样品。推断四种样品的风味差异主要来源于关键风味化合物的贡献度不同。
表4 紫米甜酒酿中已定性挥发性化合物的ROAV值
Table 4 ROAV values of identified volatile compounds in purple rice sweet wine
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3 结论
本文结合电子鼻、HS-GC-IMS两种技术，分析鉴定了热杀菌、辐照杀菌、超高压杀菌处理及未杀菌对照样品紫米甜酒酿的挥发性香气成分。通过对电子鼻传感器响应值分析，显示传感器R6（甲基类）、R7（硫化物）、R2（氮氧化合物）、R8（醇和醛酮）、R9（芳香成分）对不同杀菌样品均有较高的响应值；LDA分析能对对四种样品有很好的区分，显示超高压与未杀菌样品的挥发性成分最相似，辐照杀菌、热杀菌明显改变了样品的原风味轮廓。HS-GC-IMS结果显示不同杀菌样品共同定性定量出10种醇类，16种酯类，5种醛类，5种酮类，4种酸类，1种烯烃类，1种烷烃类共42种，7大类挥发性成分，其中醇类、酯类的种类最丰富，相对含量最高。杀菌方式对样品挥发性化合物种类构成影响较小，而对相对含量有明显影响，热杀菌处理使得样品的醇类、酸类、烯烃类物质含量的增加，酯类、醛类、烷烃类物质的减少。辐照杀菌和超高压杀菌均使得酯类、酮类、酸类、烷烃类物质增加，醇类、醛类减少。通过GC-IMS差异对比图和最邻近算法聚类分析，直观显示超高压杀菌与未杀菌对照样品风味成分最相似，其余两种杀菌方式则明显改变了样品原有的风味物质，与电子鼻分析结果相一致。ROAV值显示不同杀菌样品的风味差异主要来源于关键性风味化合物的贡献度不同。通过电子鼻与HS-GC-IMS两种技术检测结果，从宏观和微观上分析紫米甜酒酿不同杀菌及未对照样品挥发性香气成分的差异，确定超高压杀菌是紫米甜酒酿优选的杀菌方式，并为关键风味化合物综合评价方法提供参考。
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