红曲是传统的曲类中药，在我国有近千年的使用历史[1]，是以粳米为原料由曲霉科真菌红曲霉的菌丝体发酵而形成的红米曲[2]，用于食物色素、酒和肉类储存已有数百年历史[3]。红曲中的药用成分主要有洛伐他汀、红曲色素、甾醇类、十氢化萘、γ-氨基丁酸和不饱和脂肪酸等[4-5]。洛伐他汀是β-羟基-甲戊二酸单酰辅酶A 还原酶的竞争性抑制剂[6]，可抑制胆固醇的合成，增加低密度脂蛋白受体合成，临床上主要用于高血脂的治疗[7]。此外，红曲还有降低血糖、血压等作用[8-9]。纳豆冻干粉中含有一种水溶性的单链多肽丝氨酸蛋白酶，即纳豆激酶（NK），其对血栓、急性心肌梗死、脑血栓中风、脉管栓塞等血栓性疾病的预防和治疗具有一定意义[10]。有研究表明NK 具有溶解纤维蛋白的活性[11]，每天补充一定量的NK，持续两个月，可降低健康受试者体内的纤维蛋白原和凝血因子含量[12]，且NK 的纤溶活性作用效果快、安全性高[13]。纳豆红曲复合物（Natto monascus complex，NMC）是由红曲、植物甾醇、纳豆冻干粉为主要原料制成的一种保健食品，研究显示其具有辅助降血脂的效果[14-17]。
目前市面上含有红曲、纳豆等成分的保健食品种类众多，虽然已有研究显示这类保健食品具有一定的降脂溶栓药理作用，但相关实验数据仍相对较少，且缺乏相关的药物代谢动力学研究。因此，本实验旨在研究NMC 对高脂饮食（High fat diet，HFD）诱导大鼠模型血脂水平的影响。此外，由于之前的研究[18]显示NMC 中主要的降脂药效成分是洛伐他汀，因而本研究选用洛伐他汀作为指标性成分，考察了其在比格犬体内的药物代谢动力学过程，以期为纳豆、红曲类保健食品的研发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
纳豆红曲复合物（批号：20181123）购自康道生物（南通）有限公司；低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测定试剂盒（货号：A113-1-1）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（货号：A112-1-1）、总甘油三酯（Total triglyceride，TG）测定试剂盒（货号：A110-1-1）以及总胆固醇（Total cholesterol，TC）测定试剂盒（货号：A111-1-1）购自南京建成生物工程研究所；洛伐他汀胶囊（批号19021211）购自南京森贝伽生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Spectra Max iD5 多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Agilent LC-MS6420 质谱检测仪，安捷伦科技有限公司；高效液相色谱检测仪，岛津企业管理（中国）有限公司；Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱，安捷伦科技有限公司。
1.3 药物与主要试剂配制
0.5%羧甲基纤维素钠溶液（0.5% CMC-Na）的配制：精密称取CMC-Na 粉末5.0 g，加入至1000 mL加热至60 ℃后的三蒸水中，均匀铺撒于液面，80 ℃加热搅拌，现用现配。
NMC 混悬液的配制：将NMC 粉碎为粉末，过筛。精密称取16.2 g、32.4 g 和64.8 g 粉末，分别加入100 mL 的0.5% CMC-Na 溶液中混悬，配制成浓度分别为16.2 g/100 mL、32.4 g/100 mL 以及64.8 g/100 mL 的NMC 混悬液。
洛伐他汀混悬液的配制：精密称取洛伐他汀180 mg，加入100 mL 的0.5% CMC-Na 溶液中混悬，现用现配。
10%水合氯醛溶液的配制：称取10.0 g 的水合氯醛粉末，加入生理盐水100 mL 溶解，配制成4%的溶液，现用现配，使用前冷藏。
1.4 实验动物与饲料
180～220 g SD 大鼠，SPF 级，雌雄各半，购自南京青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK(沪)2018-0004。6～8 m 龄比格犬（普通级），体重约10 kg，6 只，雌雄各半，购自南京青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK(沪)2018-0007。大鼠高脂饲料（货号：TP25540）由南通特洛菲饲料科技有限公司提供。比格犬饲料购自南京青龙山动物繁殖场。饲养条件：室温22～25 ℃，相对湿度：60%±10%，自然光线，自由饮水进食，适应性饲养7 d。本实验已获得中国药科大学实验动物伦理委员会批准。
1.5 动物模型的建立及分组
SD 大鼠随机分为正常组和实验组。正常组大鼠给予普通饲料，实验组给予高脂饲料，连续喂养4 w后，于眼眶静脉丛取血1.5 mL，分别测定LDL-C、HDL-C、TG 以及TC 的水平。若实验组大鼠的血脂水平与正常组相比出现显著性差异，即为造模成功。
将造模成功的大鼠随机分为5 组，即模型组、阳性药洛伐他汀组（1.8 mg/kg）、NMC 低剂量组（162 mg/kg）、NMC 中剂量组（324 mg/kg）、和NMC 高剂量组（648 mg/kg），每组各8 只。随后，正常组大鼠给与普通饲料，而其余各组大鼠则继续给予高脂饲料，并开始灌胃给药，每天一次，连续给药4 w，正常组和模型组则给予等量的0.5% CMC-Na 溶液。
1.6 大鼠血清血脂检测
给药结束后，大鼠禁食12 h，然后于眼眶静脉丛取血1.5 mL，4 ℃静置2 h 后于4000 r/min 条件下离心20 min，取上层血清，分别使用TC、TG、HDL-C、LDL-C 试剂盒测定血脂相关指标。
1.7 色谱条件和质谱检测参数
色谱柱：EclipsePlus C18 RRHD（1.8 µm，2.1×50 mm），流动相由乙腈:水=65:35（V/V）组成，进样体积3 µL，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃，离子源温度350 ℃，去簇电压170 V，碰撞电压27 V。
质谱离子化方式：电喷雾离子化（ESI），正离子模式；多反应监测（MRM）。洛伐他汀[M+Na]+ m/z：427.2→325.2，辛伐他汀[M+Na]+ m/z：441.2→325.2。
在此条件下测得的洛伐他汀有较好的分离度。
血浆样品的处理：取500 µL 血浆置于抗凝离心管中，精密加入内标溶液1500 µL，于5 ℃、10000 r/min 条件下离心10 min，连续两次，随后吸取上层血浆移入聚丙烯管中密封，置于-80 ℃冰箱中冷冻保存备用。
1.8 内标对照品溶液的制备
精密称取辛伐他汀和甲苯磺丁脲各1.00 mg，加入乙腈定容至10 mL，即得0.1 mg/mL 的辛伐他汀和甲苯磺丁脲的混合溶液。随后用乙腈稀释至10 ng/mL，即得内标溶液。
1.9 比格犬给药方案
取6 只健康比格犬，口服给予8 片NMC。分别于给药前（0 h）和给药后0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h 和24 h 采集腿静脉血2 mL，置于抗凝的离心管中。
1.10 数据统计学处理
所有的数据结果均以mean±SEM 表示，采用单因素方差分析进行统计学分析，若p＜0.05 则表示存在显著性差异，若p＜0.01 则表示存在极显著性差异。
2 结果与讨论
2.1 NMC 对HFD 诱导大鼠血脂水平的影响
2.1.1 大鼠一般情况
适应性喂养一周后，SD 大鼠饮食正常，毛色光亮，精神状态良好，敏捷度良好，活动反应能力正常。分组喂养4 w 后，正常组大鼠无明显变化，而HFD 诱导大鼠食欲降低，毛色发黄无光泽，粪便稀溏，血液黏稠。
2.1.2 高脂血症大鼠模型的建立
如表1 所示，造模4 w 后，与正常组相比，HFD诱导大鼠的血清中LDL-C与TC 水平均显著升高（p＜0.01），TG 水平明显升高（p＜0.05），证明大鼠高脂血症模型造模成功。
表1 正常组大鼠与HFD 诱导大鼠血脂情况
Table 1 The blood fat data of normal and HFD-induced rats(mmol/L,mean±SEM)
注：#p＜0.05，##p＜0.01与正常组相比。
2.1.3 NMC 对HFD 诱导大鼠血脂的影响
给药4w 后，采用相应试剂盒测定各组大鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC 和TG 水平，结果如表2 所示。各组大鼠血清中的HDL-C 无显著性差异。与空白组相比，模型组大鼠血清中LDL-C（10.35 vs.0.28）、TC（15.29 vs.1.57）以及TG（0.44 vs.0.32）水平均显著升高（p＜0.01）。与模型组相比，NMC 低、中剂量组大鼠血清中LDL-C（8.04，8.11）以及TG（0.22，0.23）水平显著降低（p＜0.01），且NMC 高剂量组大鼠血清中LDL-C（6.53）、TC（10.53）以及TG（0.28）水平均显著降低（p＜0.01）。此外，洛伐他汀也可显著降低HFD 诱导大鼠血清中的LDL-C（7.93）、TC（11.86）以及TG（0.25）水平，但与NMC 高剂量组无显著性差异（p＞0.05）。这些结果表明，NMC 灌胃给药可降低HFD 诱导大鼠的血脂水平，其作用具有剂量依赖性，且高剂量的作用效果与洛伐他汀相当。
表2 NMC 对HFD 诱导大鼠血脂的影响
Table 2 The effects of NMC on the blood fat of HFD-induced rats (mmol/L,mean±SEM)
注：#p＜0.05，##p＜0.01与空白组相比。*p＜0.05，**p＜0.01与模型组相比。
2.1.4 NMC 对HFD 诱导大鼠肝脏病理学的影响
如图1 所示，给药4 w 后，正常组大鼠肝脏外观呈深红色，表面光滑细腻，断面无颗粒，质地柔软坚韧。模型组大鼠肝脏颜色变浅，呈淡黄色，质地变硬且易碎，断面呈颗粒状，体积变化不明显。NMC 低、中、高剂量组大鼠肝脏颜色逐渐加深，有颗粒状斑点，肝脏断面呈颗粒状，洛伐他汀组大鼠肝脏颜色则偏淡红色。
图1 各组具有代表性的大鼠肝脏外观照片
Fig.1 The representative liver photographs of rats from different groups
注：a：正常组；b：模型组；c：NMC 低剂量组；d：NMC中剂量组；e：NMC 高剂量组；f：洛伐他汀组。图2 同。
随后，本研究运用苏木精-伊红染色法检测了NMC 对HFD 诱导大鼠肝脏组织病理学的影响。染色结果如图2 所示，正常组大鼠肝细胞形态正常，细胞边界及细胞核清晰，胞浆呈粉红色（图2a）。与正常组相比，模型组大鼠肝脏组织出现炎性细胞浸润，肝细胞体积显著增大且肿胀，核颜色加深，细胞间界限不清，胞浆中出现较大的脂肪滴，将细胞核挤向一侧，呈重度脂肪样变化（图2b）。而与模型组相比，NMC中、高剂量组大鼠肝脏组织炎性细胞浸润以及脂肪样变性减轻，细胞形态明显改善，细胞间界限较为清晰，且作用效果与洛伐他汀相当（图2d～f）。
图2 NMC 对HFD 诱导大鼠肝脏组织病理学的影响（400×）
Fig.2 The effects of NMC on the liver histopathology of HFD-induced rats (400×)
2.2 NMC 药物代谢动力学研究
2.2.1 NMC 在比格犬体内的浓度-时间曲线
本研究通过HPLC 法检测，精密称定洛伐他汀标准品12.50 mg，梯度稀释，在238 nm 下测得吸光度，以峰面积积分值为纵坐标Y，进样浓度X(mg)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线Y=2685.3X+83128，r=1。精密称定纳豆红曲复合物20.00 mg，加入乙腈溶液定容至10 mL 容量瓶中，在238 nm 处测吸光度，代入标准曲线方程，计算得每20 mg NMC 复合物中含有洛伐他汀0.355 mg。
本实验运用LC-MS 技术检测比格犬给与NMC后，其血浆中洛伐他汀的浓度变化，得到的血药浓度-时间曲线如图3 所示，在比格犬体内，NMC 给药后洛伐他汀的达峰时间Tmax 为1.17 h，峰浓度Cmax 为62.33 ng/mL。
图3 比格犬口服NMC 后血浆中洛伐他汀的药物浓度-时间曲线
Fig.3 The concentration-time curve of lovastatin in the plasma from beagle dogs after oral administration of NMC(Mean±SEM,n=6)
2.2.2 NMC 在比格犬体内的药代动力学参数
随后本研究根据前面的药物浓度-时间曲线，用统计矩法计算了NMC 中洛伐他汀在比格犬血浆中的药代动力学参数，主要包括末端相消除半衰期T1/2、血药浓度-时间曲线下面积AUC、体内滞留时间MRT，以及Tmax和Cmax实测值等，具体数据如表3 所示。
表3 NMC 单次给药后比格犬血浆中洛伐他汀的药代动力学参数
Table 3 The pharmacokinetic parameters of lovastatin in the plasma of beagle dogs after a single doseof NMC
本采用LC-MS技术测定了NMC给药后比格犬血浆中洛伐他汀的浓度变化，并进行了药代动力学分析。实验结果显示，NMC 口服给药后，其成分洛伐他汀在比格犬体内的消除半衰期T1/2为5.95 h，以梯形法计算得的血药浓度-时间曲线下面积AUC(0-24)为137.40 mg/L×h，AUC(0-∞)为165.99 mg/L×h，平均体内滞留时间MRT 为7.83 h。
洛伐他汀可以通过多种方法进行检测，其中主要以HPLC 和LC-MS/MS 为主[16]。HPLC-UV 紫外检测法灵敏度较低，最低检测限较高，难以准确测定洛伐他汀的血药浓度，且LC-MS 中的选择性离子检测（SIM）模式准确度也较低，误差较大。而本实验使用的Agilent 6420 三重四极杆质谱检测仪，其多反应监测（MRM）模式可以同时准确定量样品中待测物和内标物的含量，具有高效、特异性强、灵敏高等特点，被广泛用于研究药物的代谢动力学特征。辛伐他汀为洛伐他汀的同系物，常被用作内标物，以解决质谱检测器信号相对不稳定的问题[19,20]。此外，此实验条件下洛伐他汀和辛伐他汀的[M+Na]+均比[M+H]+峰响应值高，且更为稳定，因此本实验选择[M+Na]+峰为定量峰。
之前的药物代谢动力学研究结果表明，洛伐他汀在人和比格犬血浆中的达峰时间和半衰期等数据相近[19-21]，此外也有文献对洛伐他汀缓释制剂进行研究[22,23]，但尚无有关红曲或NMC 的药物代谢动力学研究。洛伐他汀作为红曲中降脂的主要有效成分，其体内检测方法较为成熟，因此，本研究选用洛伐他汀作为红曲降脂的指标性成分，考察其在比格犬体内的药物代谢动力学过程，以期为红曲的安全性评价提供参考。本实验结果显示，比格犬单次口服NMC 后，洛伐他汀血药浓度达峰时间约为1.17 h，半衰期约为5.95 h，体内滞留时间为7.83 h，这与之前的文献报道基本相同，但峰浓度（30.05～129.33 mg/L）个体间差异较大，可能是因为实验动物存在个体差异。
3 结论
本研究表明NMC灌胃给药可降低HFD诱导大鼠的LDL-C、TG 和TC 等血脂水平，并可减轻肝脏细胞脂肪变性，且作用效果与洛伐他汀相当。而且，药代动力学实验结果表明，NMC 的有效成分洛伐他汀在比格犬体内可被正常吸收、代谢，并在12 h 之内代谢完全。本研究成果可为纳豆、红曲类保健食品的研发提供实验依据。
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