芒果（Mangifera indica Linn）属漆树科杧果属，是一种亚热带水果，深受人们喜爱[1]。芒果中富含酚类、类黄酮及维生素类等抗氧化物质[2～6]。其中主要的 酚类物质是没食子酸和单宁，黄酮类物质主要是槲皮素和异槲皮素（芦丁）[7,8]，维生素类包括Vc和VE[9]，这些物质均具有很强的抗氧化作用，使芒果抗氧化效果增强，使得芒果具有很高的药用价值，表现为对机体的抗炎性、抗癌性以及改善机体多种慢性疾病的作用[10～16]。同时Kathleen等[17]的研究也表明，芒果对肺病、白血病和前列腺癌均有一定的抑制作用，对乳腺癌和结肠癌抑制效果尤为显著，由此可见，其抗氧化作用已得到体内研究支持。
通常情况下，果蔬中多种抗氧化物质的相互作用能延缓或预防细胞氧化[18～20]。但抗氧化物的结构和浓度变化、外界物质影响等因素均可影响它的抗氧化效果[21,22]。从茶多酚抗氧化实验中可以发现，抗氧化物可以抑制氧化酶活性，且可以与自由基结合形成更稳定的物质，起到清除自由基的作用，从而达到抗氧化效果[23]。这些抗氧化效果均得到体内抗氧化实验证实，而在体外抗氧化研究中，除了莫树平等[24]利用部分现有的抗氧化物及增效剂对芒果原汁抗氧化效果进行试验外，根据芒果内部抗氧化物比例进行体外复配实验的研究未见报道。因此，本试验在我们前期试验测定了芒果中4种酚类抗氧化物质（包括：没食子酸、类黄酮、Vc及GSH）含量[25]的基础上，采用体外实验法模拟芒果中这4种主要抗氧化物及其复配组合进行自由基清除能力试验，旨在为评价芒果果实的营养保健功效提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
没食子酸，芦丁，Vc，GSH，盐酸，甲醇，草酸，EDTANa2-Fe2+，NaH2PO4，Na2HPO4，H2O2，邻苯三酚，DPPH，三羟甲基氨基甲烷（Tris），番红花红，以上试剂纯度均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。
T-25型匀浆机，德国IKA公司；BR4i型台式高速冷冻离心机，法国Jouan公司；PL203精密电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；SIM-F140型制冰机，日本三洋；UV-2100型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品配制
根据实验室分析测得芒果中主要抗氧化物含量-没食子酸为 50 mg/100 g，芦丁为 30 mg/100 g，Vc为80 mg/100 g、GSH 为 12 mg/100 g[25]，配制出 0.3 mmol/L没食子酸，0.05 mmol/L芦丁（均用1∶99盐酸-甲醇溶液作溶剂），0.46 mmol/L Vc（20 g/L 的草酸溶液作溶剂）及0.04 mmol/L GSH（去离子水作溶剂）4种母液。
将上述配制出的 4种溶液按在芒果中所占比例（没∶芦∶Vc∶GSH=50∶30∶80∶12）进行复配。Vc∶没=8∶5、Vc∶芦=8∶3、Vc∶GSH=20∶3、没∶GSH=25∶6、GSH∶芦=2∶5、没∶芦=5∶3、Vc∶GSH∶芦=8∶1.2∶3、没∶GSH∶芦=5∶1.2∶3、Vc∶没∶芦=8∶5∶3、Vc∶没∶GSH=8∶5∶1.2 及 Vc∶没∶芦∶GSH= 8∶5∶3∶1.2，复配液备用，以上配制比例均为 4种母液的浓度比。
1.2.2 ·OH 清除能力的测定
利用Fenton反应检测抗氧化物对·OH的清除作用[25]。分别取 pH 值为 7.4，0.15 M 的磷酸缓冲液 l.5 mL，260 μg/mL 的番红花红溶液 0.2 mL，2 mmol/L 的EDTANa2-Fe2+ 0.7 mL，不同的样品溶液 1 mL，最后加入3%的H2O2 0.8 mL启动反应。于37 ℃水浴保温30 min，在波长510 nm处测定吸光值A。空白组以等体积的去离子水代替样品溶液；对照组以等体积的3% H2O2代替样品溶液和EDTANa2-Fe2+溶液。
式中：A样品为样品组吸光值；A对照为对照组吸光值；A空白为空白组吸光值。
1.2.3 O2-·清除能力的测定
利用邻苯三酚自氧化体系测定抗氧化物对 O2-·清除作用[26]。取0.05 M，pH 8.25 的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，加入1 mL不同的样品液，于25 ℃条件下保温25 min，然后加入 25 ℃预温的 3 mmol/L 的邻苯三酚0.4 mL。空白组以等量Tris-HCl缓冲液代替样品，混匀后反应 4 min，加 0.5 mL 的浓盐酸终止反应，325 nm条件下，迅速测定吸光值。
式中：A样品为样品组吸光值；A空白为空白组吸光值。
1.2.4 DPPH清除能力的测定
用甲醇配制5×10-4 M的DPPH溶液，避光冷藏备用，实验设置样品组和空白组，测三组平行样，取其平均值。样品组：向 0.5 mL 5×10-4 M 的 DPPH 溶液中加入1 mL样品溶液和1 mL甲醇溶液，混匀后避光反应30 min，立即在517 nm波长处测定吸光值。空白组：用1 mL甲醇代替样品溶液。
式中：A样品为样品组吸光值；A空白为空白组吸光值[27]。
测定单一及复配组对·OH、O2-·及DPPH的清除率大小按公式1、2及3计算。
1.3 数据分析
分别用数字代表4种抗氧物及其复配组，即：没食子酸（1）、芦丁（2）、Vc（3）、GSH（4）、Vc+没食子酸（5）、Vc+芦丁（6）、Vc+GSH（7）、没食子酸+GSH（8）、GSH+芦丁（9）、没食子酸+芦丁（10）、Vc+GSH+芦丁（11）、没食子酸+GSH+芦丁（12）、Vc+没食子酸+芦丁（13）、Vc+GSH+没食子酸（14）、Vc+GSH+没食子酸+芦丁（15）。
所有试验重复 3次，试验结果用（平均值±标准偏差)表示。采用 Excel 2010软件进行数据分析及作图，采用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析，含相同字母组差异性不显著（p＞0.05），字母完全不同组差异性显著（p＜0.05）。采用皮尔森积差相关法分析数据间的相关性。
2 结果与讨论
2.1 抗氧化物对·OH清除能力比较
图1 抗氧化物对·OH清除能力的影响
Fig.1 Effect of different antioxidants on ·OH scavenging rate
注：图中所标的不同字母的值在0.05水平上差异显著。
·OH是一种非常强的氧活性物质，并且在人体中没有特定的酶能清除，是一种极具损害性的自由基，能够破坏活细胞中绝大多数分子[28,29]。由图1可知，4种抗氧化物及其复配组均具有较好的·OH的清除能力，且清除率均在 70%以上，清除效果依次为：15＞13＞8＞14＞1=2＞10＞5＞12＞9=4＞6＞7＞11＞3。单一组中，没食子酸和芦丁对·OH的清除能力显著高于其他两种抗氧化物，Vc对·OH的清除率在4种单一组分中最低，仅为72%，且显著低于其他14组（p＜0.05）；2种抗氧化物复配组合中含Vc组对·OH的清除能力相对于1、2和4组均较弱，但均高于Vc本身的清除能力。由此可见，没食子酸和芦丁对·OH均有很强的清除能力，与芒果体外消化实验中多酚和类黄酮类物质能够有效地清除·OH[30]的效果一致。Vc结合其他抗氧化物减弱了抗氧化物本身的自由基清除能力，可能是Vc优先结合·OH阻碍了其他抗氧化物与·OH结合。
2.2 抗氧化物对O2-·清除能力比较
过量的O2-·会攻击DNA，脂质和蛋白质，导致细胞损伤和凋亡，故抑制 O2-·的产生是延缓机体衰老病变的关键因素之一[31]。由图2可知，单一组对O2-·清除能力较强，均大于50%，而复配组清除能力除5，6和7组外其余相对较弱。从单一组清除率3＞4＞2＞1可以看出，Vc对O2-·清除能力相对其他单一组分明显偏高（p＜0.05）；两种抗氧化物复配组中含 Vc组对 O2-·的清除能力也明显高于其他组，其中Vc+GSH对O2-·清除率达87%，Vc+芦丁达54.50%。数据显示，1～2种抗氧化物组合对O2-·清除效果较好，尤其是Vc+GSH清除效果最佳，这可能与Vc自身的氧化还原作用有关，Vc在氧化还原过程中会降低氧含量，因此含Vc组合抗氧化能力增强[32]。而 3种及以上复配组合对O2-·清除效果明显变差，可能是由于各抗氧化物之间对O2-·有竞争作用，降低了对O2-·的清除能力。
图2 抗氧化物对O2-·清除能力的影响
Fig.2 Effect of different antioxidants on O2-· scavenging rate
注：图中所标的不同字母的值在0.05水平上差异显著。
2.3 抗氧化物对DPPH清除能力比较
图3 抗氧化物对DPPH自由基清除能力的影响
Fig.3 Effect of different antioxidants on DPPH scavenging rate
注：图中所标的不同字母的值在0.05水平上差异显著。
DPPH清除率测定法是最常见的抗氧化能力测定方法之一，该测定法简单快速，再现性强，且在室温下具有可行性[33]。由图3可知，4种单一组对DPPH的清除能力较弱，除Vc外，其余均在5%以下。而复配后DPPH清除能力得到显著提升。由数据得出，除Vc其他三种单一组对DPPH的清除能力差异性不显著（p＞0.05），趋势均较弱；当抗氧化复配组组分在2～4种时，除Vc+没食子酸对DPPH的清除能力较弱外，其余复配组合均能够增强对DPPH的清除能力，且2种抗氧化物复配时GSH能明显增加另一抗氧化物的抗氧化能力。有研究表明果蔬对DPPH的清除能力与其酚类物质的含量呈正相关[34～36]，但这些研究在某种程度上也将 Vc和 GSH在果蔬中所起的作用掩盖。可见，单一组中Vc对DPPH清除效果较强，而多种抗氧化物结合阻碍了其发挥作用，Vc对 DPPH清除能力较高的原因可能是Vc具有破坏DPPH结构的功能，提供电子与DPPH内部的孤对电子进行配对，使DPPH得到有效的清除[37]。而GSH在多种复配组中增强了清除DPPH的效果，可能与GSH清除活性氧的能力有关[38]。
3 结论
本试验采用体外法研究芒果中4种抗氧化物及其复配组合相互作用关系，结果表明：没食子酸、芦丁、Vc及GSH 4 种抗氧化物之间相互作用后对·OH、O2-·、DPPH三种自由基的清除结果各不相同。4种抗氧化物单独使用亦或复配使用均对·OH清除的能力没有太大影响；而就 O2-·清除能力而言，4种抗氧化物单独使用的作用效果好于2种复配的，更好于3种复配的；DPPH自由基清除能力结果则表明：4种抗氧化物复配使用的作用效果优于单独使用的，从整体上看 Vc +GSH组合对三种自由基清除效果最佳。本次试验可为后续研究芒果营养保健功效提供一定的理论参考。
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