摘要：本文以产自山东地区的山里红和大金星这两个常见山楂品种作为研究对象，山楂冻干制成粉末后测定它们的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性（DPPH、ORAC和PSC），并采用HPLC分析抗氧化活性成分的差异。结果显示不同品种山楂中的总酚和总黄酮含量各异，其中山里红果实的总酚（61.91mg GA equiv./g DW）和总黄酮（55.96mg catechin equiv./g DW）含量均显著高于大金星。山楂果实提取物均有较好的抗氧化活性，其中山里红品种表现出更好的抗氧化活性，其ORAC及PSC值分别是大金星的1.54和2倍。山楂果实提取液经HPLC法分析，鉴定出7种多酚类化学成分，最主要的酚类化合物为原花青素B2以及表儿茶素，且山里红果实多酚类化合物的含量显著高于大金星。综合比较发现山楂中的活性成分含量及种类各异，且山里红的抗氧化活性较强，是天然抗氧化剂的潜在原料。
关键词：山楂；总酚；总黄酮；抗氧化性
Abstract:The antioxidant properties of two common hawthorn cultivars, Shanlihong and Dajinxing, which are widely grown in the Shandong province of China, were examined. The total phenolic content (TPC), total flavonoid content (TFC), and antioxidant activity of hawthorn powder prepared by freeze-drying weremeasured. Antioxidant activity was assessed based on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity, oxygen radical absorbance capacity (ORAC), and rapid peroxyl radical scavenging capacity (PSC). Moreover, differences in the identity and quantity of active components with antioxidant activities between the two cultivars were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The TPC and TFC of the Shanlihong extract (61.91mg gallic acid equivalents/g DW and 55.96mg catechin equivalents/g DW, respectively) were significantly higher than those of the Dajinxing extract. While both of the hawthorn fruit extracts had high antioxidant activity, the Shanlihong extract showed higher antioxidant activity than the Dajinxing extract, with a 1.54-fold higher ORAC and a two-fold higher PSC. Analysis of the hawthorn fruit extracts by HPLC led to the identification of seven polyphenols. Procyanidin B2and epicatechin were the predominant phenolic compounds in both the Shanlihong and Dajinxing cultivars, and the polyphenol content of the Shanlihong cultivar was significantly higher than that of the Dajinxing cultivar. This comprehensive evaluation shows that the quantity and type of bioactive components in hawthorn differ between different cultivars, and that the Shanlihong cultivar, which has stronger antioxidant activity than the Dajinxing cultivar, is a potential source of natural antioxidants.
Key words:hawthorn; total phenolics; total flavonoids; antioxidant activity
山楂（Crataegus spp.），蔷薇科苹果亚科山楂属，灌木或落叶乔木。我国山楂属植物资源和蕴藏量丰富， 栽培历史悠久，距今已有1700多年，东北、京津、辽冀、山东和太行山区是山楂的五大产区[1]。山楂具有很高的营养和药用价值，为我国传统的药食同源植物。山楂富含原花青素、黄酮醇、碳苷黄酮及其花青苷、酚酸等酚类化合物，但由于山楂品种、产地和采摘期等不同，山楂果实中的主要活性成分含量和种类都存在差异。目前文献报道的山楂黄酮类物质主要有：槲皮素类、芹菜素、二氢黄酮类和山奈酚类等。此外，山楂中还含有大量的原花青素类化合物[2]。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）是机体产生的正常代谢物。在正常情况下，活性氧处于动态平衡中，一旦体内ROS过剩时，则会导致构成细胞的物质如糖类、脂质、蛋白质和DNA等发生氧化损伤，从而引起心脑血管和动脉硬化等多种疾病[3]。机体一般通过内源性的抗氧化物（Vc、VE和辅酶Q等）与外源性的抗氧化物（类黄酮、多酚和花色苷等）清除多余的ROS，以此保持机体的健康。由于植物多酚结构存在羟基基团，可与机体内自由基结合，从而消灭自由基，是良好的天然抗氧化剂。有研究报道，植物多酚具有多种生物活性，可有效降低心血管疾病、糖尿病和癌症等非传染性疾病的发病率，促进记忆、抑制神经炎症和防止老年痴呆等生理功能[3,4]。植物多酚的这些生理学功能与它的抗氧化能力有密切的关系[5]。
山楂具有良好的生物活性和营养性，深入了解山楂植物功能活性成分的含量以及抗氧化活性，对于进一步研究山楂的体内生物活性，挖掘提高其营养价值，更大程度地发挥其保健功能具有重要意义。目前对山楂的抗氧化活性的研究很多，但多集中在鲜果或山楂药材上。本研究将山楂鲜果冻干后采用80%丙酮水溶液提取山楂中活性成分，定量测定其总酚、总黄酮含量，通过高效液相色谱（HPLC）法分析其抗氧化活性成分的差异，并采用1,1-二联苯基-2-苦肼（DPPH）自由基清除能力测定法、氧自由基吸收能力测定法（ORAC）以及过氧自由基清除能力测定法（PSC）测定山楂的抗氧化活性，以期通过比较两个不同品种山楂的活性成分和抗氧化活性，更加全面地了解山楂这一植物资源，同时也为山楂的深入研究提供参考。
山里红、大金星5 kg鲜果于2014年10月采摘于山东潍坊，样品清洗去籽后于冷冻离心机冻干，粉碎后过60目筛子，收集筛下物备用；福林酚试剂购自广州化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水溶性维生素 E（Trolox）、ABAP、没食子酸、儿茶素、绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、对香豆酸、金丝桃苷、异槲皮苷和荧光素钠均购自于美国Sigma公司。
DU730分光光度计，美国贝克曼库尔特有限公司；868型pH计，美国Orion公司；T25均质机，德国IKA公司；N-1001旋转蒸发器，日本EYELA公司；Allegra X-I5R冷冻离心机，BECKMAN 公司；Filter Max F5酶标仪，美国Molecular公司；1525高效液相色谱仪，美国Waters公司。
1.2.1 游离型多酚化合物的提取
多酚化合物的提取参考 Prasad的报道[6]，采用80%丙酮水溶液提取法提取山楂样品中的游离型多酚类化合物。粉碎后的山楂与 4℃ 80%丙酮以质量比=1:15混合，利用高速均质机持续作用3min（10000 r/min），将混合液离心（1843.4 g，10min，4℃），过滤，取清液。剩余的果渣重复上述步骤两次。将上述上清液合并，并移至旋蒸瓶，采用真空旋转蒸发仪进行浓缩(-0.1 MPa，45℃)，直至总体积小于 10mL。将浓缩液转移到10mL容量瓶，用超纯水定容，然后再分装至小离心管中，置于-20℃冰箱中保存。测定其多酚、总黄酮、多酚化合物种类以及抗氧化活性。
1.2.2 粗提物总酚含量的测定
提取物中总酚含量的测定采用福林酚比色法[7]，以没食子酸为标准品，总酚含量以每克水果样品干重相当于没食子酸的毫克数（mg GA equiv. /g DW）表示。每个样品做三个平行。
1.2.3 粗提物总黄酮含量的测定
粗提物中总黄酮的含量采用硼氢化钠-四氯苯醌比色法进行测定[8]，以儿茶素为标准品，总黄酮含量以每克水果样品干重相当于儿茶素的毫克数（mg catechin equiv. /g, DW）表示。每个样品做三个平行。
1.2.4 粗提物的HPLC分析物
色谱条件，色谱柱：Sunfire C18反相色谱柱（4.6×250mm，5 μm，Waters，USA）。流动相：0.1%三氟乙酸水（A），乙腈:甲醇（4:1）（B）。洗脱程序：0～5min，3% B；5～8min，4～10% B；8～12min，10% B；12～15min，10～12% B；15～26min，12～14% B；26～32min，14～18% B；32～48min，18～20% B；48～53min，20～25% B；53～63min，25～80% B；63～66min，80～3% B；66～70min，3% B。流速：1.00mL/min。检测波长280nm，340nm；柱温：35℃；进样量：10 μL。
1.2.5 抗氧化活性测定
1.2.5.1 粗提物对DPPH自由基清除能力的测定
方法参考Wen等[9]并稍作修改，即取0.1mL不同浓度样品溶液加入2.9mL DPPH（0.1mM，溶于甲醇），混匀，室温下避光静置30min，测定517nm处的光吸收值。其中，以0.1mL样品溶液加入2.9mL甲醇为对照，以甲醇为空白调零，所有样品都采用三次平行试验，样品浓度表示为样品在体系中的终浓度。计算公式如下：
其中，反应样品溶液的吸光值为 As；0.1mL样品溶液和2.9mL甲醇混合溶液的吸光值为 Ac；0.1mL甲醇和 2.9mL DPPH混合溶液的吸光值为A。最后以半抑制浓度（IC50）表示抗氧化能力。
1.2.5.2 粗提物的氧自由基吸收能力(ORAC)的测定
总抗氧化能力的测定采用氧自由基吸收能力（ORAC）法，参考Wen等[10]的方法。ORAC值用μmol Trolox/g样品来表示。
1.2.5.3 粗提物过氧自由基清除能力(PSC)的测定
参考Wen等[10]的方法。样品提取液抗氧化能力用PSC 值（μmol Vit.c equiv. /100 g, DW）来表示，每个样品至少三次重复数据，以x±SD表示。
1.2.6 统计分析
采用IBM SPSS 21.0软件分析实验数据，平均值的差异性用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的LSD检验，p＜0.05为有统计学差异。实验重复3次。
表1 山里红和大金星粗提物的总酚和总黄酮含量
Table 1 Total phenolic content and total flavonoid content of Shanlihong and Dajinxing hawthorn fruits
注：表中不同字母表示不同品种之间具有差异性显著（p＜0.05）。
材料 总酚含量 /(mg GA equiv. /g DW) 总黄酮含量 /(mg catechin equiv. /g DW)山里红 61.91±1.65b 55.96±3.57b大金星 52.62±0.81b 44.25±8.76a
从表1可知，山里红果实80%丙酮粗提物的总黄酮含量显著高于大金星的果实提取物，但两者总酚含量并无显著性差异。
从目前的文献报道来看，两个不同品种山楂的总酚、总黄酮含量存在差异，主要受两方面因素的影响：基因差异和外部环境差异（如植物生长条件、果实的成熟度、采摘后的处理和运输环节的影响）。另外，根据Wen等[10]人的研究结果，山里红和大金星鲜果提取物的总酚含量分别为 66.67±1.21mg GA equiv. /g DW和 59.19±1.52mg GA equiv. /g DW，总黄酮含量分别为 61.77±1.20mg GA equiv. /g DW 和 46.20±1.24mg GA equiv. /g DW。本实验采用冻干的方法对两种样品进行了前处理，与直接用鲜果提取相比，山里红和大金星总酚含量的损失分别为7.14%和11.10%，总黄酮含量的损失分别为 9.41%和4.22%。这表明，采用冻干的处理方法对山楂果实中的总酚、总黄酮含量的影响较小。结合郭泽美[11]的研究结果可知，冻干法与晒干、烘干等加工方法相比，更能有效避免果实中抗氧化成分的损失。
2.2.1 山楂提取物HPLC分析品所含多酚化合物的种类。如图1所示，本实验通过HPLC分析鉴定出山楂提取物主要含有七种酚类物质，分别为儿茶素、绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、对香豆酸、金丝桃苷以及异槲皮苷。
图1 山楂标准品（a）及山里红（b）和大金星（c）样品提取
物的液相色谱图
Fig.1 Chromatograms of HPLC standards and hawthorn fruit extracts
注：a，标准品；b，山里红；c，大金星。1-儿茶素；2-绿原酸；3-原花青素 B2；4-表儿茶素；5-对香豆酸；6-金丝桃苷；7-异槲皮苷。
表2 山里红和大金星提取物的HPLC分析结果
Table 2 HPLC analysis of Shanlihong and Dajinxing extracts
注：表中不同字母表示不同品种之间具有差异性显著（p＜0.05）。
酚类物质的种类 不同山楂的品种中的含量/(mg/100 g DW)山里红 大金星 儿茶素 40.99±0.87b 42.74±0.47a绿原酸 128.8±4.21a 90.48±8.75b原花青素B2 734.5±12.43a 300.1±11.51b表儿茶素 536.4±11.48a 239.2±7.96b对香豆酸 70.42±3.19a 34.31±0.90b金丝桃苷 16.53±0.54b 27.06±0.89a异槲皮苷 7.04±0.34b 15.35±0.86a
根据HPLC的吸收峰面积及其相应化合物的标准曲线可计算出各种酚类化合物的含量，具体数据见表2。
实验结果表明，两种山楂提取物中原花青素 B2和表儿茶素的含量显著高于其他酚类化合物。通过HPLC检测出的山里红提取物所含的七种酚类物质中，原花青素B2的含量占总量的47.86%，表儿茶素则占34.95%，其他五种酚类物质总共仅占17.19%。此外，大金星提取物所含的七种酚类物质中，原花青素B2的含量占总量的40.05%，表儿茶素则占31.93%，其他五种酚类物质总共仅占28.02%。这表明，原花青素 B2和表儿茶素是这两个品种的山楂所含的最主要的酚类物质。这一结果和前人的研究结果类似，Liu等[12]人发现山楂中主要酚类化合物为原花青素类化合物，其中表儿茶素和原花青素B2含量最高，分别为90～1170 和 70～1240mg/100 g DW，且不同品种之间的差异性较大。
由表2可知，山里红提取物中主要酚类化合物的含量从高到低依次为原花青素B2、表儿茶素、绿原酸、对香豆酸、儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷，其中前四种化合物的含量均显著高于大金星，而后三种化合物的含量均稍低于大金星。总的来说，山里红提取物中酚类化合物的总含量比大金星高，这与总酚含量的测定结果一致。
水果和蔬菜中的多酚物质能有效地清除体内自由基，从而防止因自由基过剩而产生的生物大分子损伤，具有较强的抗氧化能力，是天然抗氧化剂的潜在资源[13]。由图2和图3可知，山楂果实的粗提物对DPPH自由基清除能力均表现了明显的量效关系：随着浓度的增大，自由基清除能力显著提高。由表3可知，通过计算得出的半抑制浓度IC50值，山里红低于大金星，表明山里红果实提取物具有更高的抗氧化活性。
图2 山里红果实粗提物对DPPH自由基的清除活性
Fig.2 DPPH radical-scavenging activity of Shanlihong hawthorn fruits
图3 大金星果实粗提物对DPPH自由基的清除活性
Fig.3 DPPH radical-scavenging activity of Dajinxing hawthorn fruits
2.3.1 粗提物对DPPH自由基的清除能力
山楂提取物的ORAC值如表3所示。本实验测得的数据表明，不同品种的山楂粗提物的ORAC值与总酚、总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力的趋势一致。这可能暗示着山楂提取物中的多酚类物质（原花青素B2和表儿茶素等）含有大量酚羟基，可通过转移氢原子来阻断自由基链式反应的过程，从而发挥抗氧化活性。许红星等[14]的研究结果也证实了这一推测，他们分析比较了十种常见水果的抗氧化活性（ORAC）与总酚含量的相关性，结果表明总酚含量高的提取物的 ORAC值显著高于总酚含量较低的提取物，且ORAC值与总酚含量之间呈线性相关。
2.3.2 粗提物的氧自由基吸收能力(ORAC)
表3 山里红和大金星果实粗提物的抗氧化能力
Table 3 Antioxidant capacities of Shanlihong and Dajinxing hawthorn fruits
原料 DPPH IC50值/(mg/mL) ORAC 值/(μmol Trolox /g DW) PSC 值/(μmol Vit. c equiv. /g DW) 山里红 2.49±0.05 1871±44 246.1±12.07 大金星 3.18±0.20 1211±152 113.8±16.35
两个不同品种的山楂的氧自由基吸收能力相比较，山里红的 ORAC 值（1871±44 μmol Trolox /g DW）显著高于大金星（1211±152 μmol Trolox /g DW），即山里红提取物表现出比大金星提取物更高的抗氧化能力。这与之前测得的总酚含量以及DPPH自由基清除能力的结果相一致。
2.3.3 粗提物的过氧自由基清除能力(PSC)
根据表3可知，两种山楂果实粗提物的PSC值：山里红高于大金星。与DPPH自由基清除能力测定和ORAC法的结果一致，山里红果实提取物表现出比大金星更高的抗氧化活性。
本研究中山楂粗提物的活性成分组成和抗氧化活性成分与之前Wen等人[10]报道的结果有些差异，主要原因是山楂的具体产地不同，且本研究用山楂冻干粉测定，故造成结果方面有些不同。
研究结果发现，品种会显著影响山楂的生物活性成分、种类及抗氧化活性。山里红果实的总酚和总黄酮含量均显著高于大金星果实。通过HPLC法对山里红和大金星果实的提取液分析，鉴定出7种多酚类化学成分，且山楂所含的最主要的酚类化合物为原花青素B2以及表儿茶素，山里红果实多酚类化合物的含量显著高于大金星。采用DPPH自由基清除能力，氧自由基吸收能力以及过氧自由基清除能力三种方法评价山里红和大金星果实的80%丙酮提取物的抗氧化能力，发现山楂果实提取物均有较好的抗氧化活性，其中山里红品种的抗氧化活性更强。
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Bioactive Compounds of Different Hawthorn Cultivars and Their Antioxidant Activities
文章篇号：1673-9078(2017)9-91-95
DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.9.013
收稿日期：2017-01-30
基金项目：广东省自然科学基金项目（2014A030313242）；中央高校基本科研业务费项目（2015ZZ110）；广东省特支计划青年拔尖人才项目（2015TQ01N670）；广州市珠江科技新星项目（201610010096）