图1 揉捻过程PPO活性变化
Fig.1 Variation in the PPO activity in rolling process
摘要：为明确揉捻过程中温度对工夫红茶加工品质的影响，分析了不同温度条件下，浙江小叶种工夫红茶揉捻中在制品PPO、POD酶活性，以及成品茶感官品质、理化品质以及香气成分的变化。研究结果显示，低温20±2 ℃时揉捻叶的PPO、POD酶活性保留较高，成品茶茶黄素含量显著增加，茶汤色差亮度L值与红色度a值提高，茶多酚和咖啡碱等成分的含量显著下降，醛类、醇类和酮类等香气成分的形成得到显著性增加，特别是苯乙醛、芳樟醇、橙花叔醇、紫罗酮及香叶基丙酮等红茶重要香气成分的含量显著增加。因此，低温下的揉捻方法可作为提升工夫红茶品质的一种新的技术工艺。
关键词：工夫红茶；揉捻；温度；品质
揉捻是塑造工夫红茶隽秀外形和风味品质的关键工序。工夫红茶揉捻使叶片表观呈现出叶色由绿转黄、茶条逐渐卷紧的现象，而叶片细胞在撕扯、挤压及摩擦等多种力的作用下，相互隔断的内部结构打破，内含成分相互接触、交融和反应[1]，细胞内含成分相互结合，促进了工夫红茶芳香物质种类和含量的增加[2,3]，如芳樟醇及其氧化物、香叶醇和水杨酸甲酯等[4]，β-糖苷酶酶促水解作用下形成大量香气前体物。特别是多酚类物质与多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）的接触氧化，是形成红茶品质最重要的化学变化[5]。
一直以来，揉捻研究主要集中于揉捻过程物料的物理特性变化和揉捻方式的比较，且以绿茶和乌龙茶为主，如比较不同揉捻方式下茶叶物理特性及茶叶品质的变化[6,7]；揉捻过程中压力变化对茶叶细胞内外电阻及细胞壁与细胞膜之间电容的影响[8]；根据采摘标准和萎凋程度优选最佳揉捻时间[9]；明确叶片韧性及可塑性的最佳状态[10]。然而，针对工夫红茶揉捻过程中，内含物质发生的剧烈化学变化以及温度条件对工夫红茶揉捻品质影响的研究鲜有报道。
近年来，在浙南茶区，已出现利用控温手段调节揉捻环境温度提升绿茶品质的新技术。因此，本文拟通过分析不同温度下，工夫红茶揉捻在制品PPO和POD酶活性的差异，以及对感官品质、理化成分的影响，探明温度对提升工夫红茶品质的作用。
1.1 原料和仪器设备
1.1.1 鲜叶原料
试验用茶青品种为迎霜，嫩度以一芽二叶为主，2015年3月25日采自浙江武义更香有机茶业开发有限公司基地。
1.1.2 试验仪器设备
50型萎凋室空气处理机组（余姚市姚江源茶叶茶机有限公司）；6CR-25型揉捻机（浙江绿峰机械有限公司）；6CHF红茶发酵机（福建佳友茶叶机械有限公司）；6CHX-70烘焙提香机（福建佳友茶叶机械有限公司）；PL202-L电子天平（梅特勒-托利多仪器）；MA150型快速水分测定仪（德国赛多利斯科学仪器公司）；手动SPME进样器(美国Supelco公司)；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取SPME纤维头（美国Supelco公司）；Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；UV-3600分光光度计(岛津公司)，DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；PA401(A3)立柜式冷暖空调（广东美的制冷设备有限公司）；NPS7-13T（广州美的环境电器制造有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 加工工艺及实验处理
萎凋：鲜叶摊于竹篾盘上，每平方米摊叶0.6 kg，竹篾盘放于萎凋架上，萎凋架移入萎凋室内，萎凋室采用空气处理机组控制温度28～32 ℃、相对湿度为60%～70%，待萎凋叶含水量降至56%～58%时，将萎凋叶充分混匀，进行揉捻试验。
揉捻：揉捻过程分为空压5 min，轻压5 min，中压5 min，重压5 min四个阶段，各阶段依次进行，全程耗时60 min；至揉捻叶细胞破碎在85%以上，叶片90%以上成条，条索卷紧，茶汁稍有外溢并粘附于叶表面，方为揉捻适度。实验设定3个温度处理，即低温20±2 ℃、中温30±2 ℃、高温40±2 ℃，在3个约8 m2的木质压缩板搭建的实验房中进行。采用空调以及电暖气加热的方式控制温度，在距离揉捻机桶壁30 cm处放置温度计，监控揉捻环境的温度变化。待环境温度稳定后，开始揉捻实验。
解块：使揉捻后结成团块的揉捻叶充分解散，每批次揉捻叶解块2次。
发酵：由发酵机控制发酵温度30 ℃、相对湿度90%以上，发酵叶叠放厚度5 cm左右，发酵时间3.0 h以叶片变红、叶脉转色、甜香显露即可。
干燥：采用烘焙提香机分2次干燥：毛火温度为120 ℃，烘至含水量20%～30%，茶条基本干硬，嫩茎稍软；足火温度为95 ℃，烘至含水量5%～7%，茶梗一折即断，手捻茶条成粉末。
1.2.2 试验检测方法
揉捻过程中，每15 min取样1次，液氮固样，用于检测过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性、茶黄素(TFs)、茶红素(TRs)和茶褐素(TB)含量。揉捻后样品进行发酵，干燥等工序，成品茶进行感官品质评价、理化成分检测、香气成分分析等。
（1）酶活性检测：采用愈创木酚氧化法[11]测定过氧化物酶(POD)活性，采用邻苯二酚法[12]测定多酚氧化酶(PPO)活性。
（2）TFs、TRs及TB含量的检测，参考刘飞[1]使用的方法。
（3）感官审评：采用GB/T 23776-2009方法[13]进行感官品质评价。
（4）理化成分检测：茶多酚含量检测方法[14]采用GB/T 8313-2008；游离氨基酸总量的检测方法[15]采用GB/T 8314-2013；咖啡碱含量检测方法[16]采用GB/T 8312-2013；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[17]。
（5）香气检测方法参考吕海鹏等人的方法[18]进行改进，具体如下：
SPME法提取香气成分：称取磨碎茶样10.0 g装入80 mL样品瓶中，加盖密封，分别加入3 mL沸超纯水，加盖密封，于60 ℃水浴锅中平衡5 min，吸附55 min后，于气质联用仪进样口230 ℃解析3.5 min，进行GC-MS分析。
GC条件：DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.250 μm）弹性石英毛细管柱；程序升温：50 ℃保持2 min；以3 ℃/min升至80 ℃；以2 ℃/min升至180 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；柱箱50 ℃，进样口温度为230 ℃；流速1.2 mL/min；进样方式：不分流进样。
MS条件：离子源EI，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；色谱质谱接口温度230 ℃；质量扫描范围35～400 u。
1.2.3 数据处理
香气检测结果经标准化合物谱库NIST质谱库对照，结合保留指数和相关文献[19～21]进行结构表征，以各组分峰面积占总峰面积的百分比表示相对含量。
试验数据采用SPSS 19.0软件进行分析。
2.1 揉捻过程酶活性变化及工夫红茶主要色素变化
2.1.1 揉捻过程PPO、POD酶活性变化
图1 揉捻过程PPO活性变化
Fig.1 Variation in the PPO activity in rolling process
图2 揉捻过程PDO活性变化
Fig.2 Variation in the POD activity inh rolling process
揉捻过程中，细胞液泡内多酚类物质与酶系统的区域化隔离被破坏，酶类与内含物质相接触，良好的介质条件如适宜pH值、较高的底物浓度等有助于适度增高酶的活性；随着揉捻进程的延续，代谢产生的有机酸、丰富的产物积累使起初较适宜的介质条件改变，酶的活性随之下降。
如图1所示，在低温与中温的环境条件下，在揉捻的前15 min内PPO的活性逐步增加，增加幅度分别是起始时的40.22%和51.75%；随着揉捻过程的延续，PPO的活性逐步降低，直到揉捻完成时分别降低为起始时的29.38%和42.68%。而在高温条件下，整个揉捻过程PPO的活性都在降低，直至揉捻完成时降至起始时的58.94%。由此可知，在揉捻工序完成后，无论低温、中温或高温条件，最终PPO的活性都在降低，相对而言，低温条件下揉捻，PPO的活性得到更高的保留。
不同温度条件下揉捻，POD活性变化规律与PPO活性变化有所不同。如图2所示，中温与高温的环境条件下，在揉捻的前15 min内POD的活性逐步增加，增加幅度分别为起始时的26.18%和37.45%；随着揉捻过程的延续，POD的活性逐步降低，直到揉捻完成时分别降低幅度为起始时的45.93%和56.77%。而在低温条件下，POD活性在前30 min都无较大变化，直至揉捻结束时，POD活性降低幅度为起始时的24.4%。由此可知，在低温、中温、高温条件下揉捻，最终POD的活性都发生了下降；而相对于中温、高温条件，低温条件下揉捻，POD活性降低较为平缓，最终的POD活性保留更高。
综上可知，低温揉捻过程结束后PPO、POD的活性得到较好的保留，这可能与低温处理使叶片水分散失较少，蛋白酶类始终处于一个相对稳定的介质环境条件有关[22,23]；另一方面较低的温度使各类催化反应进行缓慢，作为多种蛋白酶变性剂的多酚类物质，对PPO、POD活性的影响也降低了[24]。
2.1.2 揉捻过程TFs、TRs及TB含量变化
在揉捻过程中，由于PPO、POD等的酶促氧化作用，决定工夫红茶叶底及茶汤色泽的TFs、TRs及TB等色素类物质也在逐步形成，但在不同的揉捻温度条件下积累量不同。
表1 揉捻过程样品TFs、TRs和TB含量检测结果
Table 1 Measurement results of the effect of rolling process on the TFs, TRs, and TB contentof samples
时间/min 低温中温TFs/% TRs/% TB/% TFs/% TRs/% TB/% 0 0.296±0.013 3.147±0.008 1.186±0.014 0.296±0.013 3.147±0.008 1.186±0.014 15 0.361±0.001 3.215±0.076 1.164±0.009 0.327±0.009 3.779±0.203 1.472±0.099 30 0.363±0.011 3.507±0.078 1.302±0.074 0.325±0.005 4.063±0.221 1.818±0.085 45 0.387±0.012 3.672±0.061 1.742±0.037 0.336±0.014 4.288±0.032 2.546±0.106
60 0.414±0.008 3.615±0.058 2.088±0.123 0.344±0.011 4.315±0.037 2.915±0.082时间/min 高温TFs/% TRs/% TB/% 0 0.296±0.013 3.147±0.008 1.186±0.014 15 0.338±0.005 4.065±0.158 1.835±0.108 30 0.323±0.004 4.229±0.117 2.516±0.087 45 0.351±0.023 4.402±0.126 2.950±0.056 60 0.352±0.011 4.752±0.098 3.836±0.160
如表1所示，在不同揉捻温度条件下，TFs的含量均随揉捻时间的延长而增加。在中温、高温条件下TFs增长缓慢且增长较少，在低温揉捻条件下TFs含量增长较快，揉捻完成时增幅达39.68%。TRs和TB含量在不同揉捻温度条件下均随揉捻时间的延长而增加，但与TFs的变化规律不同，中温、高温条件下揉捻TRs和、TB含量增长较快，而低温揉捻条件下则增长缓慢。
2.2 成品茶感官品质及茶汤色差分析
2.2.1 成品茶感官审评结果分析
表2 感官审评结果
Table 2 Sensory evaluation results
样品 外形(25%) 汤色(10%) 香气(25%) 滋味(30%) 叶底(10%) 总分评语 分数评语 分数 评语 分数评语 分数 评语 分数低温 紧结、弯曲、乌润、褐、显锋苗90 红亮 91 高纯 91 甜爽(鲜度高) 91 红亮 88 90.5中温紧结、弯曲、乌润、显锋苗，稍有单片88 红、尚亮 88尚高、稍闷88尚爽 88红、较亮 87 87.9高温紧结、弯曲、乌润、带锋苗、稍有单片88 尚亮 87尚高 87尚爽 88红、尚亮 87 87
将不同温度条件下揉捻处理样品经统一的发酵、干燥处理制得成品茶，并进行感官审评，结果如表2所示。低温条件下揉捻处理制得的成品茶在5项感官评价因子中的得分均高于中温、高温，尤其在汤色、香气、滋味方面得分更高；中温条件下揉捻的成品茶在汤色、香气方面略优于高温。
2.2.2 成品茶茶汤色差分析
表3 茶汤色差值检测结果
Table 3 Measurement results of the color difference in sample liquors
注：同一列不同小写字母表示在p＜0.05水平有显著差异。
样品 L a b低温 87.73±1.22a23.60±1.64a75.30±2.24a中温 77.41±1.50b17.12±1.79b78.09±2.29a高温 69.61±0.75c17.97±1.31b77.82±1.04a
对不同揉捻处理制得的成品茶茶汤进行色差值检测，结果如表3所示，低温揉捻成品茶茶汤L值最高，即亮度最高，与中温和高温揉捻达到显著性差异；低温揉捻成品茶茶汤a值最大，即红色最好，与中温和高温揉捻达到显著性差异，表明低温揉捻成品茶汤色更红；不同揉捻处理间茶汤b值未达显著性差异。试验结果表明，低温条件下的揉捻可提高工夫红茶茶汤的色泽和亮度。
2.3 成品茶主要内含品质成分分析
2.3.1 理化品质成分含量结果分析
由表4可知，低温揉捻处理TFs含量最高，中温、高温条件下TFs含量差异不显著；中温揉捻处理TRs含量最高，较之高温条件差异不显著，低温揉捻处理TRs含量最低，与中温、高温处理差异显著；TB含量随着揉捻温度上升呈显著性增加。结合图1中的结果分析，中温揉捻过程中多酚氧化酶活性提高快，使多酚氧化形成的TFs更快更多地转化为TRs和TB，因而TFs含量更低，TRs和TB含量更多；而高温揉捻过程中，PPO处于其最适反应温度条件下，尽管活性低于低温、中温处理，但是更有利的反应条件可能加强了TFs的形成以及向TRs和TB的转化。
表4 不同处理样品主要品质成分含量
Table 4 Content of the main quality components in different samples
注：同一列不同小写字母表示在p＜0.05水平有显著差异。
样品 TFs/% TRs/% TB/% 茶多酚/% 游离氨基酸/% 可溶性糖/% 咖啡碱/%低温 0.444±0.012a3.423±0.201b4.143±0.095c13.221±0.133b3.153±0.603a4.299±0.134b2.558±0.092b中温 0.332±0.017b4.378±0.071a4.562±0.048b14.654±0.261a2.793±0.160b5.367±0.122a3.202±0.043a高温 0.328±0.017b4.195±0.043a6.255±0.120a14.632±0.038a2.939±0.063b5.481±0.127a3.219±0.192a
低温处理茶多酚含量显著低于其他两组处理，可能与揉捻完成后PPO和POD较高的酶活性有助于茶多酚的转化有关，这对于增强茶汤的醇和口感有一定作用。低温处理显著提高游离氨基酸含量，而可溶性糖、咖啡碱的含量均显著低于中温和高温处理，这一结果也显示了低温处理改善滋味成分的重要作用。
2.3.2 香气成分变化
图3 不同揉捻处理样品挥发性物质相对质量分数变化
Fig.3 Change in relative content of volatile compounds in the samples treated with different rolling processes
注：柱状图上的不同小写字母表示不同处理样品挥发性物质的差异有统计学意义(p＜0.05)。
已有研究[25]表明,工夫红茶中香气成分物质主要包括醛类、醇类、烯类、酮类和酯类，其中醛类[26]和醇类[27]所占香气物质含量最高。由图3所示，本试验的结果也充分印证了它们是工夫红茶主要的香气物质，特别是醛类、醇类所占比例分列第一、第二位。本实验结果显示，不同揉捻温度处理的成品茶在主要香气类别总量上存在显著性差异。特别是低温揉捻处理样品醛类、醇类、酮类成分的含量显著高于中温、高温揉捻处理；高温处理样品在酯类和烯类表现出最高的含量；且其醛类、醇类和酮类均显著高于中温揉捻。
具体到不同揉捻处理，不同挥发性物质的质量分数也存在差异，如表5所示，醛类香气成分中，低温揉捻处理不仅在检测出的香气物质数量上多余于另外两组处理，而且2-甲基丁醛、正己醛、顺2-己烯醛、2-庚烯醛、苯乙醛、辛醛和反-2-辛烯醛等的含量也具有显著性优势，它们是中国红茶普遍具有的香气物质[28]。在醇类香气成分中，低温处理样品在β-芳樟醇、橙花醇、十五醇和顺-橙花叔醇等具有花香或果香的物质显著高于其他处理组分，特别是芳樟醇和橙花叔醇认为是小叶种红茶的特征香气成分[29,30]；高温处理在2-甲基十六醇、2-甲基十五醇含量上表现出显著优势，但是对工夫红茶整体香气的贡献尚不明确。在烯、酯、酮类物质的差异分析中，低温处理也表现出一定优势，如水杨酸甲酯、3,5-辛二烯-2-酮、α-雪松烯、紫罗酮和香叶基丙酮等红茶香气重要贡物质[31]；高温处理检出具有果香的顺-己酸-3-己烯酯和柠檬香的α-柠檬烯的含量显著高于其他处理，说明高温处理对于这些香气物质含量的提升有一定作用。
表5 不同揉捻处理样品中显著性差异的香气物质及其含量
Table 5 Aroma compounds and their relative content with significant differences between samples treated with different rolling processes
类别 香气成分 香型[4,25～28]香气物质相对质量分数 保留时间/min低温 中温 高温2-甲基丁醛 果香，甜香 5.92a- - 3.593醛类3-甲基丁醛 果香 - 4.42b7.76a3.677正己醛 青草气，果香 2.19a- 0.58b5.871顺2-己烯醛 清香 3.15a2.29b0.19c7.506 2-庚烯醛 青草气 0.15a- - 11.573苯甲醛 甜香 6.26c6.92b8.41a11.802
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注：表中数值是各挥发性物质的色谱峰面积占色谱峰总面积的百分比,所有数据为3次平行试验结果的平均值。“-”表示该挥发性物质未检测到。同行数据后的不同小写字母表示在p＜0.05水平差异有统计学意义。
辛醛 果香，茉莉香 0.80a- - 13.75反-2-反-4-庚二烯醛 清香 1.55c1.62b1.93a14.112苯乙醛 水仙花香 18.27a17.22b15.37c15.784反-2-辛烯醛 脂肪香 0.76a0.59b0.47c16.557 2-壬烯醛 玫瑰香 0.75b0.96a- 22.45藏红花醛 木香，草药香 0.39a- - 24.803癸醛 花果香 1.20c1.38a1.24b25.341 β-环柠檬醛 柠檬香 1.07b1.12a0.71c26.057 2-苯基丁烯2-醛 花香，蜜香 - - 1.98a29.096 4-甲基-2-苯基戊烯-2-醛 可可香 1.39c1.99a1.71b35.278 5-甲基-2-苯基己烯-2-醛 蜜糖香 0.61c0.97a0.89b42.574醇类2-烯基癸醇 肉香 0.18a- - 9.262 β-芳樟醇 玉兰花香 9.49a8.38c9.21b18.925橙花醇 玫瑰香 2.50a1.99b1.54c28.836 3,7,11-三甲基十二醇 花香 0.36a0.17b- 32.365 2-甲基十六醇 - 0.13c0.16b0.35a33.579十五醇 玫瑰香 0.30a- - 40.591 2-甲基十五醇 - - - 0.27a43.351 2-甲基十六醇 - 0.44a- 0.30b46.988顺-橙花叔醇 花果香 1.38a- - 47.334水杨酸甲酯 草药香 5.85a4.97c5.62b24.362顺-己酸-3-己烯酯 果香 - 0.63b0.79a36.33癸酸乙酯 椰香 1.06b0.85c1.39a37.302烯类 α-柠檬烯 果香，柠檬香 - - 2.11a15.051 α-雪松烯 木香 1.06a0.83b0.72c38.356酯类酮类3,5-辛二烯-2-酮 甜香 1.08a0.89b0.82c18.498 α-紫罗酮 紫罗兰香 1.16a0.93c1.04b38.771反-香叶基丙酮 果香，木香 4.02a0.79c2.90b40.449 β-紫罗酮 木香，果香 3.10a2.37b2.30c42.231
3.1 本文比较分析了不同温度条件下揉捻处理样品PPO和POD酶活性变化。结果显示，揉捻过程中，PPO和POD酶活性呈先升高后下降的趋势，且在低温揉捻条件下酶活性保留相对较高，这可能与低温条件减少了酶与邻醌等物质的结合有关[32]。同时，比较分析了成品茶的内含品质成分：低温揉捻样品的TFs含量较高，TRs含量适中。其中TFs与茶汤滋味的鲜爽度和汤色的亮度成正相关，而TRs影响滋味的浓度、汤色的红度，含量太高，汤色变暗，而含量太低，茶汤红浓不够[33]，这一结果也与感官审评结果和汤色色差分析结果相对应，即低温揉捻样品汤色亮度较高、红艳程度较强。此外，低温条件下较低的茶多酚、咖啡碱保留以及较高的氨基酸含量，对于茶汤鲜爽滋味的形成也起到了重要作用。另一方面，对香气成分的分析结果显示，低温揉捻在香气种类和香气含量上均超过中温、高温处理，特别是一些工夫红茶重要香气成分如2-甲基丁醛、正己醛、顺2-己烯醛、苯乙醛、辛醛、反-2-辛烯醛、β-芳樟醇、橙花醇、十五醇、顺-橙花叔醇、水杨酸甲酯、3,5-辛二烯-2-酮、α-雪松烯、紫罗酮和香叶基丙酮等的含量，都显示出显著性优势。
3.2 综上所述，低温揉捻(20±2 ℃)工艺能够在最大程度上保留PPO和POD等酶的活性，有效调节TFs、TRs以及TB三种色素的比例关系，显著提升香气物质的种类以及含量，同时对于成品茶茶汤色泽、香气、滋味等品质的提升作用明显。因而，低温揉捻可以作为提高工夫红茶加工品质的有效技术手段。
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Influence of Rolling Temperature on Physicochemical Quality of Congou Black Tea
Abstract：In order to identify the effect of rolling temperature on the quality of Congou black tea, the peroxidase (PPO) and polyphenoloxidase (POD) activities of Zhejiang small leaf Congou black tea prepared under different rolling temperatures were analyzed, and the changes in sensory quality, physicochemical quality, and aroma components in the final tea products were examined. The results showed that with a low rolling temperature (20±2 ℃), high PPO and POD activities were maintained in the tea, theaflavin content was significantly increased in the final tea product, and the L value (brightness) and a value (redness) of the tea liquor were increased. The content of tea polyphenols and caffeine were significantly decreased, and the formation of aldehydes, alcohols, ketones, and other aroma components were significantly increased. In particular, the content of benzene acetaldehyde, linalool, nerolidol, ionone, geranyl acetone, and other important aroma components in the black tea were increased remarkably. Therefore, rolling at lower temperature can serve as a new and effective technique to enhance the quality of Congou black tea.
Key words：Congou black tea; rolling; ambient temperature; quality
文章篇号：1673-9078(2017)5-168-175
DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.5.027
收稿日期：2016-06-02
基金项目：杭州市科研院所技术开发研究专项（20152231E13）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）；国家星火计划重点项目（2015GA700006）