利用电子鼻检测6种商业果汁饮料中脂环酸芽孢杆菌的污染

摘要：脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的特性和产芽孢的能力，在果汁中萌发繁殖会使产品出现异味，导致腐败。本文将筛选得到的分离菌株XC-6和购自德国菌种保藏中心的标准菌株DSM 3922分别等量接种到6种果汁饮料，采用FOX 4000电子鼻结合主成分分析对接种样品与正常样品进行对比分析，发现电子鼻可快速有效鉴别出经不同处理的样品，其中第一主成分累积方差贡献率均大于95%。GC-MS分析表明接种样品相较于正常样品，挥发性物质图谱存在着差异，特征表向物质含量的差异可以被电子鼻用来鉴别正常样品与污染样品。在水蜜桃乳饮料和水果牛奶混合饮料中均检出了脂环酸芽孢杆菌的特征代谢产物邻乙氧基苯酚和愈创木酚，它们的含量显著高于正常样品。本实验表明电子鼻可以根据样品气味图谱的不同而对污染样品做出准确的鉴别，是可以将电子鼻作为早期快速检测脂环酸芽孢杆菌污染的检测工具。

关键词：脂环酸芽孢杆菌；果汁饮料；电子鼻；主成分分析；GC-MS

果汁饮料独特的气味不仅能给人以愉悦的感官享受，还在一定程度上表征着产品的品质。脂环酸芽孢杆菌是果汁饮料中常见的污染性微生物，革兰氏阳性细菌，非致病菌，可产芽孢[1]，其细胞膜上特有的ω-脂环族脂肪酸使其具备了显著的耐热、耐酸特性[2]，这些特性使其在80 ℃的环境和在pH低于4.0的酸性条件下均可正常生长，且能以芽孢的形式存活于经商业杀菌的果汁饮料产品中[2～7]。脂环酸芽孢杆菌污染的产品无明显气体生成，在初期很难将其与正常产品分开，在后期储存及销售过程中，其芽孢萌发繁殖，代谢产生愈创木酚和卤代酚等[6～8]，使产品出现类似烟熏味、药水味或消毒剂的异味，甚至形成白色沉淀[5,9]。当这样的产品出现在市场上时，会对企业造成巨大的经济损失。在当今国际贸易中已严格要求进出口浓缩果汁中该菌的检出量不得超过10 CFU/mL，因此建立一种在污染初期能快速准确检测脂环酸芽孢杆菌的方法是果汁饮料行业亟待解决的问题。目前常用检测方法有微生物学方法、色谱分析技术[11～13]和生物分析技术[14,15]。微生物学方法操作最为简便，但耗时长，可能出现假阳性结果。色谱分析法对仪器要求较高，样品前处理比较繁琐。生物分析技术是利用分子生物学技术手段如 16S rDNA对产品中的目标菌进行检测，成本较高[15,16]。

电子鼻通过模拟人类嗅觉系统来实现对检测对象的品质评价，主要通过气味指纹信息对气体或挥发性成分做定性或定量的检测[17～19]，脂环酸芽孢杆菌污染的样品相较于正常样品，主要在挥发性物质图谱上存在着差异，采用电子鼻对气味进行感知分析，不需繁琐的样品预处理，分析时间短[19]，为果汁饮料中脂环酸芽孢杆菌的快速检测提供了可能。目前应用电子鼻技术检测判别脂环酸芽孢杆菌仅在实验室中进行，尚未推广到工厂实际应用中。本实验以六种市售商业无菌果汁饮料为实验原料，采用 FOX4000电子鼻对正常果汁样品和接种脂环酸芽孢杆菌果汁样品进行测定，通过主成分分析进行鉴别，并结合GC-MS技术检测样品中的特征气味物质，分析电子鼻能鉴别样品的物质基础，为其能对果汁饮料进行快速、准确的鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.1.1 商业果汁饮料

选取外包装完好、无外漏，在保质期内无防腐剂添加的6种果汁饮料，详情见表1。将果汁饮料在无菌条件下分装入灭菌后的玻璃瓶中密封保存。

本试验选取2株脂环酸芽孢杆菌，一株为本实验室从玉米果汁饮料中分离得到的XC-6，经分子生物学鉴定为 Alicyclobacillus spp.，NCBI登陆号为KJ158157；一株为购自德国菌种保藏中心的标准菌株Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922。

BAT 液体培养基（g/L）[6]：MgSO4·7H2O 0.50，CaCl2·2H2O 0.25，（NH4）2SO4 0.20，KH2PO4 3.0，酵母膏2.0，葡萄糖5.0，痕量盐溶液1 mL（痕量盐溶液(g/L) ： CaCl2·2H2O 0.66 、 ZnSO4·7H2O 0.18 、CuSO4·5H2O 0.16、MnSO4·H2O 0.15、CoCl2·5H2O 0.18、H3BO3 0.10、Na2MoO4·2H2O 0.30），蒸馏水1000mL。用0.5 mol/L H2SO4调pH值至3.7，115 ℃灭菌30 min，冷却待用。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HNY-200D恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；SPX-250B生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；YXQ-LS-30SLL立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AR522CNOHAUS电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；pHi560 pH计，美国Beckman Coulter公司；FOX 4000电子鼻，法国 AlphaM.O.S.公司；Agilent7890A型气相色谱仪，Agilent公司；Agilent 5975C 质谱仪，Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS的SPME萃取头，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种扩培与纯化

将2株脂环酸芽孢杆菌挑取少量接种于250 mL BAT液体培养基中，于45 ℃、200 r/min摇床中震荡培养48 h，无菌条件下以4000 r/min离心15 min获得菌体沉淀，用无菌生理盐水冲洗沉淀得到菌悬液，再对菌悬液以4000 r/min离心15 min，重复上述操作3次，得到无异味的菌体沉淀。

1.3.2 微生物接种与计数

将所获的两株菌的沉淀等量接种于6种商业果汁饮料中，控制接种量为102 CFU/mL，对照组不接种任何菌株（不同处理的样品命名见表2）。将接种组和对照组于80 ℃水浴30 min，快速冷却至45～65 ℃，让菌体以芽孢形式存在于饮料样品中。将经不同处理的样品置于45 ℃恒温培养箱中培养30 d，并使用BAT平板计数测定样品中脂环酸芽孢杆菌的数量。

1.3.3 电子鼻分析

法国Alpha M.O.S FOX4000电子鼻，配有18种金属氧化物传感器（LY2/LG，LY2/G，LY2/AA，LY2/GH，LY2/gCTL，LY2/gCT，T30/1，P10/1，P10/2，P40/1，T70/2，PA2，P30/1，P40/2，P30/2，T40/2，T40/1，TA/2）、自动进样器HS100和SOFTV12.3软件[18]。

在10 mL旋口顶空瓶中加入1 mL待测样品，加盖密封静置1 h，使其气-液平衡，然后置于进样器上自动进样分析。以载气为合成干燥空气，流速为 150 mL/min，注射体积2.5 mL（注射针总体积5.0 mL），注射针温度50 ℃，注射速度2.5 mL/s，获取时间90 s，延滞时间300 s。每个样品重复分析4次，并将由电子鼻获得的数据进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）[18]。

分别准确量取5 mL经不同处理的果汁样品于10 mL钳口样品瓶中，加入2.60 g NaCl，20 μL内标物环己酮，环己酮的浓度为0.946 mg/mL，密封后于磁力搅拌器上 60 ℃平衡 30 min，采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在60 ℃下顶空吸附40 min，插入GC进样口解析5 min进行GC-MS分析[18]。

采用 Agilent 7890型气相色谱仪，毛细管柱为DB-WAX（30 m×320 μm×0.25 μm)。升温程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，再以 8 ℃/min升至 220 ℃，保持 3 min，进样口温度250 ℃。质谱条件：离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，离子化方式EI，电子能量70 eV，质量扫描范围为 30～550 u/sec[18]。

定性分析：应用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定，分析结果运用计算机谱库（NIST05a）进行初步检索及资料分析，再结合文献的保留指数进行比对并进行人工谱图解析，确认挥发性物质的各个化学组成。

定量分析：用内标法进行定量，内标物为环己酮。

各挥发性成分的含量(μg/mL)=各组分的峰面积×内标物质量(μg)/[内标物峰面积样×样品量(mL)]

将由GC-MS获得的挥发性物质含量进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）确定各指标反映物质。

试验结果以平均值±标准误差(Mean±SE)表示，所有试验均进行3次重复。用SPSS 17.0统计软件对数据进行方差分析和主成分分析，Origin 8.5软件画图。

2 结果与讨论

2.1 微生物计数结果

将 6种商业果汁饮料分别接种等量的标准菌株DSM 3922和分离菌株XC-6，与未经接种处理的空白对照组共同置于45 ℃培养箱中厌氧培养，将培养30 d后的果汁饮料在BAT平板上进行计数培养，菌落总数见表 3，结果表明在未接种的果汁饮料中均未检测出脂环酸芽孢杆菌，而经过接种处理的果汁饮料则有不同数量的菌落生长。

以水蜜桃乳饮料样品中检出量最大，菌落总数达到了106 CFU/mL，与初始接种量102 CFU/mL相比有显著的增长，其次是水果牛奶混合饮料样品，菌落总数达到了104 CFU/mL，脂环酸芽孢杆菌在这两种果汁饮料中生长更为显著，可能与这两种饮料的pH稍高于其他饮料有关，更接近其最适生长pH。混合果汁饮料和草莓复合果汁饮料的菌落总数稍大于初始接种量，菌落总数分别达到了102 CFU/mL和103 CFU/mL，而在橙汁饮料样品和苹果汁饮料样品中，菌落总数的检出量反而小于初始接种量，表明该环境下脂环酸芽孢杆菌可以生长，但可能缺乏菌种大量繁殖的营养物质。对于水蜜桃乳饮料样品和混合果汁饮料样品，标准菌株的菌落总数大于分离菌株，而在草莓复合果汁饮料样品和水果牛奶混合饮料样品中，前者的菌落总数小于后者。

2.2 电子鼻分析

从经不同处理的6种果汁饮料中随机抽样4次进行电子鼻分析，将被测样品的数据进行主成分分析，建立二维坐标图，横纵坐标为提取的前两个主成分，6种果汁饮料样品的主成分分析图如图1所示。

其中，6种样品的第一主成分均解释了原始数据矩阵95%以上的信息，说明PC1包含了大量信息，两个主成分的累计贡献率均达98%以上，可有效解释原始矩阵的绝大部分信息。由图中可以看出，经不同处理的果汁饮料可被明显区分开，除了WCZ和BZCM的样品组内间距稍大，其它同一处理样品的组内间距在PC1方向上距离均很小，在PCA图中分布得较为紧密。WTR、WGZ、WCZ和WNN偏向于第一主成分增大的方向，WPG和WCM则偏向于第一主成分减小的方向。在6种果汁饮料中，接种了标准菌株的样品相较于接种了分离菌株的样品均偏向于第二主成分增大的方向。

2.3 GC-MS分析

在电子鼻判别分析的同时，采用GC-MS检测经不同处理的6种商业果汁饮料样品挥发性成分的种类及数量，分析脂环酸芽孢杆菌污染果汁饮料的挥发性图谱，从而将其与正常样品进行鉴别区分，为利用电子鼻能快速有效对该菌污染进行鉴定提供理论依据。

根据脂环酸芽孢杆菌在果汁饮料中的生长情况，将其分为三类，水蜜桃乳饮料和水果牛奶混合饮料的大量繁殖组，混合果汁饮料和草莓复合果汁饮料的少量繁殖组，橙汁饮料和苹果汁饮料的基本生长组。

经 GC-MS分析，在水蜜桃饮料样品中，BZTR检测出50种挥发性物质，FLTR检测出50种挥发性物质，WTR检测出46种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图2a，由图可知，相较于WTR，BZTR与FLTR在酯类、醇类、酸类、酮类和烯烃类物质含量上均有不同程度的降低，新生成了醛类物质。在水果牛奶混合饮料样品中，BZNN检测出56种挥发性物质，FLNN检测出64种挥发性物质，WNN检测出62种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图2b，三种处理的果汁均含有较高的酯类和醇类物质，相较于WNN，BZNN与FLNN在酸类、醛类物质和烯烃类物质含量上均有显著地降低。脂环酸芽孢杆菌在这两种果汁中有较明显的生长繁殖，代谢了果汁饮料中原有的一些挥发性物质，同时也产生了一些新的物质，并最终对果汁饮料的挥发性气味产生影响。

经GC-MS分析，在混合果汁饮料中，BZGZ检测出60种挥发性物质，FLGZ检测出58种挥发性物质，WGZ检测出65种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图 2c，由图可知，相较于 WGZ，BZGZ与FLGZ在酯类物质含量上有所升高，而在醇类、酮类、烯烃类物质含量上均降低了。在草莓复合果汁饮料中，BZCM检测出32种挥发性物质，FLCM检测出38种挥发性物质，WCM检测出30种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图 2d，相较于 WCM，BZCM与FLCM在酯类、醇类物质含量上均升高了，FLCM中新生成了酮类物质，BZCM中新生成了烯烃类物质。脂环酸芽孢杆菌在这两种果汁中有少量的生长繁殖，在混合果汁饮料中，各类物质的含量没有很明显的区别，但是果汁的挥发性气味已发生了改变，可能是在生长繁殖过程中改变了挥发性物质的种类。在草莓复合果汁饮料中，脂环酸芽孢杆菌明显代谢消耗了酯类和醇类物质，醛类物质含量的差异表明不同的菌种对挥发性物质的代谢也不一样。

经GC-MS分析，在橙汁饮料中，BZCZ检测出68种挥发性物质，FLCZ检测出37种挥发性物质，WCZ检测出71种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图2e，由图可知，相较于WCZ，BZCZ与FLCZ在在醇类物质含量上均升高了，而在酮类、烯烃类物质含量上均降低了，FLCZ中生成了大量的酸类物质。在苹果汁饮料中，BZPG检测出 56种挥发性物质，FLPG检测出54种挥发性物质，WPG检测出54种挥发性物质，挥发性物质的种类及含量见图2f，由图可知，相较于WPG，BZPG与FLPG在酯类、醇类、酸类、酮类物质含量上均有所升高，在醛类、烯烃类物质含量均降低了。脂环酸芽孢杆菌在这两种果汁中只有基本的生长，不同菌株的代谢情况在橙汁饮料中有明显的差别，而在苹果汁饮料中则没有表现出这种特征。

在接种处理的水蜜桃乳饮料和水果牛奶混合饮料中均检测出了含量很高的愈创木酚和邻乙氧基苯酚，在前者中愈创木酚最高可达86.53 mg/L，邻乙氧基苯酚最高可达92.84 mg/L，后者中愈创木酚最高可达74.01 mg/L，邻乙氧基苯酚最高可达19.32 mg/L，这两种物质是脂环酸芽孢杆菌的特征代谢产物，在未接种处理果汁样品和其他4组接种处理果汁样品中均未检出，这与脂环酸芽孢杆菌在这两种饮料中大量繁殖有关。

2.4 主成分分析

利用SPSS 17.0软件分别对经不同处理的6种果汁饮料的挥发性物质的含量进行主成分分析，得到主成分的特征值和特征向量见表4。由表可知，6种果汁饮料的第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）的累积贡献率均为 100%，主成分分析一般提取主成分包含90%以上信息，因此提取的2个主成分足以说明该数据的变化的趋势。

由6种果汁饮料的挥发性物质的成分矩阵系数可知，在水蜜桃乳饮料中，PC1反映的指标主要有乙醇、柠檬烯、戊酸戊酯、2-壬酮、辛酸；PC2反映的指标主要有异戊酸乙酯、醋酸异戊酯、2-庚酮、正辛醇和月桂酸。在混合果汁饮料中，PC1反映的指标主要有己酸乙酯、己酸，2-丙烯酯、丁酸，3-己烯酯、丁位突厥酮和马索亚内酯；PC2反映的指标主要有甲基环庚烷、2-羟基-3-甲基-6-甲基乙基-2-环己烯酮、丙二酸、3,5-二叔丁基邻苯二酚和3-甲基丁醇。在橙汁饮料中，PC1反映的指标主要有壬醛、1-甲基-4-（1-异丙烯基）-苯、呋喃甲醛、4-（2,6,6-三甲基-2-环己烯）-3-丁烯酮和2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇；PC2反映的指标主要有桉油精、2-甲基环戊酮、戊烷基环丙烷、异胡薄荷醇酯、α-杜松醇。在苹果汁饮料中，PC1反映的指标主要有呋喃甲醛、丙二酸二乙酯、对乙基苯酚、5-羟甲基糠醛、1,2-苯甲酸，丁基辛酯；PC2反映的指标主要有乙醇、D-柠檬烯、2,4-癸二烯醛、苯乙醇和十一酸。在草莓复合果汁饮料中，PC1反映的指标主要有己酸乙酯、2-甲基四氢噻吩-3-酮、1-（4-甲基苯基）-乙酮和3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醇、苯酚；PC2反映的指标主要有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、1-己醇和 6,11-二甲基-2,6,10-十二碳三烯醇。在水果牛奶混合饮料中，第1主成分反映的指标主要有己烷、己醛、4-乙基-1,3-苯二酚和乙基香兰素、香草醛；第2主成分反映的指标主要有异戊酸异丁酯、丁酸庚酯、3-甲氧基丙酸、卞醇和 5-庚基-2,3-二氢呋喃酮。

6种果汁饮料反映主成分的指标物质各不相同，但主要指向醇类、酯类、酸类和酮类物质，其指标物质含量见图 3，可发现在经不同处理的同一种果汁饮料中指标物质的含量确实存在着较大的差异，其差异在一定程度上反映了不同处理样品间醇类、酯类、酸类和酮类物质的差异，将这几类物质用来评价果汁饮料的挥发性物质组成，使得其可通过鉴定挥发性物质图谱的差异来区别正常样品与脂环酸芽孢杆菌污染的的样品。

3 结论

3.1 本研究将从玉米果汁饮料中分离得到的芽孢杆菌和购自德国菌种保藏中心的脂环酸芽孢杆菌分别接种到6种商业果汁饮料中，与未经接种处理的饮料样品厌氧条件下45 ℃培养30 d，未处理的饮料样品均无脂环酸芽孢杆菌检出，而经接种处理后的样品均有不同程度的脂环酸芽孢杆菌生长，其中水蜜桃乳饮料检出量最大，达到10 CFU/mL，水果牛奶混合饮料和草莓复合果汁饮料检出量次之，而对于澄清型饮料橙汁饮料和苹果汁饮料则检出量最小，菌落总数小于 102 CFU/mL。

3.2 为了达到可以快速有效地检测出被脂环酸芽孢杆菌污染的产品的目的，对经不同处理的饮料样品进行电子鼻分析，发现采用 FOX4000电子鼻可以准确地将正常样品与脂环酸芽孢杆菌污染的样品区分开，并且第一主成分（PCA）累计方差贡献率均大于98%，完全可以有效解释矩阵中的绝大部分信息。电子鼻不仅可以将污染样品与正常样品区分开，还可对接种不同芽孢杆菌的样品也进行一定程度的区分，因此将电子鼻用于快速鉴别样品是否被污染是可行的。

3.3 电子鼻主要是将气体中的不同化学信号经传感器转化为电信号，最后再转化为数字信号进行数据分析，为了验证电子鼻是确实能有效快速检测出污染样品与正常样品的不同，对经不同处理的饮料样品进行GC-MS分析。结果表明经脂环酸芽孢杆菌污染之后的样品与正常样品相比，挥发性物质的种类和含量均有显著地改变。含量高的成分不一定代表着样品的典型香气，因此用主成分分析法对6种果汁饮料样品分别进行分析，均提取出2种主成分，可以包含原始数据的全部信息，主成分分析表明虽然不同的果汁饮料样品的第1主成分和第2主成分反映的指标物质不同，但主要以醇类、酯类、酸类和酮类物质为主，而这四类物质也是样品中主要的挥发性物质，这些物质含量的差异使得不同处理的样品间的挥发性物质图谱显示出一定的差异，从而导致电子鼻接受到的化学信号也不同，因此可以鉴别正常样品与脂环酸芽孢杆菌污染的样品。

3.4 在水蜜桃乳饮料和水果牛奶混合饮料中，由于脂环酸芽孢杆菌大量繁殖，生成了大量的愈创木酚和邻乙氧基苯酚，这两种挥发性成分都是脂环酸芽孢杆菌的特征代谢物质，在其他4种饮料样品中并未检出这两种物质，可能与菌在不同基质中的生长特性与繁殖速度有关。

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Detection of Alicyclobacillus spp. Contamination in 6 Commercial Beverages by Electronic Nose

ZHONG Wu, LI Er-hu, GUO Xiao-li, GUO Xiao, WANG Mei-yu, ZHANG Yu-sha
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract: Alicyclobacillus has the character of high tolerance to acid and heat and the ability of producing spore, which can germinate and propagate in the fruit juice and then make the products smell bad and cause corruption. In this study, the isolated strain XC-6 and standard strain DSM 3922 obtained from the German bacterial collection center were inoculated equally into 6 kinds of fruit juices, respectively. FOX 4000 electronic nose combined with principal component analysis was used for the analysis of inoculated samples and normal samples. The results showed that the electronic nose could identify the contaminated samples quickly and effectively from 6 kinds of fruit juices and’ the cumulative variance contribution rates of the first principal component were more than 95%. GC-MS analysis showed that the prints of volatile compounds between inoculated samples and normal samples were different. The difference of some typical substances content could be used to identify contaminated samples and normal samples by electronic nose. Adjacent ethoxy phenol and guaiacol, the characteristic metabolites of Alicyclobacillus, were detected in the peach beverage and fruit milk mixed drinks, of which the content was significantly higher than the normal samples. The experiments showed that the electronic nose could identify the contaminated samples accurately according to the difference of the juice samples smell maps, which could be used as a testing tool for early detection of Alicyclobacillus pollution.

Key words: Alicyclobacillus; fruit juices; electronic nose; principal component analysis; GC-MS

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31201414）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划（T201725）

作者简介：钟武（1992-），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工

通讯作者：李二虎（1982-），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术