摘要：为了探究红松壳中主要活性成分的含量及其与抗氧化活性之间的相关性，试验以伊春红松壳为原料，使用不同浓度乙醇溶剂提取红松壳多酚、黄酮和多糖并分析其含量，采用SPSS软件分析松壳中活性物质与抗氧化活性之间的相关性。试验结果表明，当乙醇的浓度为40%时，红松壳多酚、黄酮和多糖得率均最高，分别为4.05 mg/g、1.7 mg/g和7.05 mg/g。抗氧化活性试验表明，红松壳多酚抗氧化活性显著高于黄酮和多糖，与Vc抗氧化活性相当。其中松壳多酚对DPPH·的IC50（半数清除率浓度）值是0.20±0.05 μg/mL，对·OH的IC50值是13.04±0.04 μg/mL，对总还原力的IC50值是40.15±0.06 μg/mL。相关性分析结果也表明松壳多酚与抗氧化活性相关性最高，其中松壳多酚与DPPH·相关性是0.908，与·OH相关性是0.989，与总还原力相关性是0.989（p＜0.01），可以看出松壳多酚是主要的抗氧化成分。本实验研究的结果为伊春红松壳副产物的综合利用以及开发天然抗氧化剂提供了科学依据。
关键词：红松壳；多酚；黄酮；多糖；抗氧化
细胞或组织除在正常生理代谢过程中产生自由基，当受到烟酒、紫外线照射和环境污染等因素影响时，将会产生大量的自由基，打破自由基的平衡状态，导致细胞内生命分子的氧化损伤[1]，继而会诱导帕金森氏病、动脉粥样硬化、老年痴呆症、关节炎和肿瘤等各种疾病产生[2]。因此，开发安全有效的抗氧化类药物和抗氧化剂显得非常重要。目前，合成的抗氧化药物种类较少，且存在毒副作用，而黄酮、多酚、多糖和生物酶等天然活性物质具有一定的抗氧化功能，成为人们研究和开发的热点。
红松（Pinus koraiensis）又名果松、红果松，其果实富含多糖、多种脂肪酸、蛋白质和矿物质等营养成分，对动脉粥样硬化、胆固醇有明显的调节作用[3]。随着对红松果实的开发，其副产物松壳资源越来越丰富，仅作为废弃物或者农家燃料，不能被充分利用，造成了资源的浪费。目前已有研究表明松子壳中富含多种功能性成分[4]，具有良好的抑菌、抗氧化和抗肿瘤等生物活性[5,6]。Yi J[7]等研究发现松多酚能平衡氧化系统和抗氧化系统比例防止失调，降低由氧化引起的疾病发生率。巴西松树黄酮能够有效地猝灭单线态氧（1O2），保护质粒DNA，抑制Fenton反应中产生的脂质过氧化物[8]。马尾松多糖明显的抑制人肝癌HepG2细胞G2/M期的增殖，从而防止癌细胞扩散，降低癌症的死亡率[9]。但是近年来关于松壳中抗氧功能成分的研究仅局限于单一物质的抗氧化性研究，而对于松壳中多酚、黄酮和多糖等成分与抗氧化功能之间相关性比较的研究报道较少[10]。
因此，本实验以伊春红松壳为原料，采用乙醇溶剂提取多酚、黄酮和多糖三种成分，通过SPSS等统计分析多酚、黄酮、多糖三者与抗氧化功能的相关性比较，旨在确定松壳中抗氧化能力最强的活性成分，为开发松壳抗氧化有效成分和促进松壳资源的综合利用提供科学依据。
红松壳，黑龙江省伊春市。
DPPH（Aldrich公司）；抗坏血酸（Sigma公司）；没食子酸标准品、葡萄糖、芦丁、福林-酚、硫酸铁、水杨酸、铁氰化钾、三氯化铁、亚硝酸钠、硝酸铝和三氯乙酸等试剂均为国产分析纯。
Buchi旋转蒸发仪器（瑞士Buchi公司）；UV-2250型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司公司）；FW80高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器公司）；8601精密pH计（上海康代仪器有限公司）TG16台式高速离心机、AUW220D电子天平（郑州长城科工贸有限公司）；DZF-6053真空干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）。
1.3.1 原料预处理
红松壳低温干燥，粉碎后40目过筛，用石油醚脱脂，低温干燥至恒重，备用。
1.3.2 红松壳活性物质的提取
准确称取1.0 g经预处理的红松壳粉于烧杯中，按照1：50料液比加入0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇溶液，振荡摇匀，50 ℃水浴提取3 h，冷却至室温后，4000 r/min离心10 min，吸取上清液浓缩以除去杂质与乙醇。
1.3.3 松壳多酚含量测定
参照 E.Aspe[11]福林-酚比色法，稍作改动，测定红松壳浓缩液液中多酚的含量。以没食子酸质量（mg）为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为：
式中：x为没食子酸质量，μg；y为吸光值
准确吸取1.0 mL样品于10 mL棕色容量瓶中，加入 5.0 mL 10%福林-酚试剂，充分振荡后静置 5 min，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，加入蒸馏水定容至刻度线，摇匀，25 ℃恒温水浴1 h，测定765 nm波长处吸光度。计算样品中的总多酚含量，单位为mg/g。
式中：C是红松壳提取物中多酚类物质浓度含量，mg/mL；V是红松壳提取物体积，mL；M是红松壳质量，g。
1.3.4 松壳总黄酮含量测定
采用 A.Hosu[12]方法，稍作改动。以芦丁为标样，测定松壳中黄酮的含量，以芦丁质量（mg）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准工作曲线方程为：
式中：x为芦丁质量，mg；y为吸光值。
将浓缩液稀释至一定浓度，准确吸取适量样品于10 mL容量瓶中，加0.3 mL 5% NaNO2溶液，混匀，充分反应6 min，加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液混匀，充分反应6 min，随后加4 mL、1 mol/L NaOH溶液摇匀，用60%乙醇定容至10 mL，保持15 min。以试剂空白调节零点，在波长510 nm处测定吸光度。计算样品中黄酮含量，单位为mg/g。
式中：C是松壳提取物中黄酮浓度含量，mg/mL；V是松壳提取物体积，mL；M是红松壳质量，g。
1.3.5 松壳总多糖含量测定
参照文献[13]，以葡萄糖为标样，测定多糖含量，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准工作曲线方程为：
式中：x为葡萄糖质量浓度，mg/mL；y为吸光值。
取稀释一定浓度的浓缩液，加蒸馏水至 2.0 mL，加1 mL 6%苯酚混匀，沿管壁加入5 mL浓硫酸，振荡混匀，静置 20 min。以试剂空白调零，在490 nm波长处测定吸光度。计算样品中多糖含量，单位为mg/g。
式中：C是红松壳提取物中多糖浓度含量，mg/mL；V是红松壳提取物体积，mL；M是红松壳质量，g。
1.3.6 DPPH·自由基清除能力的测定
按照S.Cengiz的方法测定红松壳活性物质DPPH清除率[14]，取2.0 mL一定浓度的样品溶液于10.0 mL比色管中，加2.0 mL、0.1 mmol/L DPPH溶液（无水乙醇配制），以等体积的无水乙醇代替样品液作空白组，以等体积的无水乙醇代替DPPH作对照组。在避光条件下放置30 min后，在波长517 nm处测定吸光值，实验3次取平均值。以Vc为阳性对照来评价活性物质的DPPH自由基清除率。
式中：A0为空白组的吸光值；A1为待测组的吸光值；A2为对照组的吸光值。
1.3.7 OH自由基清除能力的测定
在Nagalt等[15]报道的方法上稍作改进。取1.0 mL不同浓度的样液于试管中，加 1.0 mL、6 mmol/L FeSO4溶液，加入1.0 mL、6 mmol/L H2O2溶液，振荡摇匀，静置10 min，再加入1.0 mL、6 mmol/L水杨酸（50%乙醇作溶剂），静置30 min，于波长510 nm处测定吸光值；用等体积蒸馏水代替样品液作空白组；用等体积蒸馏水代替水杨酸作对照组，实验3次取平均值。以Vc为阳性对照来评价活性物质的羟基自由基清除率。
式中：A0为空白组的吸光值；A1为待测组的吸光值；A2为对照组的吸光值。
1.3.8 总还原能力的测定
参照 E.Tsantili[16]采用铁氰化钾还原显色法进行还原能力的测定。取 1.0 mL待测溶液于试管中，加1.0 mL、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6），加1.0mL、1%铁氰化钾溶液振荡混匀，50 ℃水浴20 min。取出冷却至室温，加入 1.0 mL的 10%三氯乙酸溶液，3000 r/min离心10 min，取上清液1 mL后依次加入1.0 mL蒸馏水和0.2 mL、0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，静置15 min后在波长700 nm下测吸光度值，蒸馏水代替样品液作空白组。实验 3次取平均值。以 Vc为阳性对照来评价活性物质的总还原能力。
式中：A0为空白组的吸光值；A1为待测组的吸光值。
数据结果以平均值±标准方差（means±SD）表示，数据处理，结果采用统计分析软件 SPSS 21.0与Origin 8.5进行统计分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。
本试验采用了不同浓度的乙醇提取红松壳中的多酚、黄酮和多糖，并分析了三种活性物质的得率变化，试验结果见图1。
图1 不同浓度乙醇提取活性物质的得率
Fig.1 The yields of active substances extracted by different concentrations of ethanol
从图1结果可以看出，松壳中含有丰富的活性物质，多糖、多酚和黄酮的含量随着乙醇浓度的增加得率呈现先增大后降低的趋势。根据相似相溶原理，溶剂与被提取物质极性相似有利于提取[17]，乙醇浓度过高和过低其极性与多糖、多酚和黄酮的极性不匹配，所以导致松壳多糖、多酚和黄酮提取得率降低。从结果中还可以看出，当乙醇浓度为 40%时得率最高，其中松壳多糖得率高 7.05 mg/g，多酚得率达到4.05 mg/g，黄酮的得率最小为1.7 mg/g。其中乙醇浓度对多酚得率影响的结果与苏晓雨等[18]研究结果一致，乙醇浓度40%是物质的最佳提取浓度，松壳中多酚得率可达到 5.01 mg/g。使用同浓度乙醇提取马尾松松针总黄酮时，在料液比 1：20的情况下，总黄酮的提取率可以达到1.59%[19]。王薇薇[20]使用水提醇沉法提取多糖，多糖得率为3.68%。
研究表明，红松壳多酚、黄酮和多糖均具有抗氧化功能，但是关于红松壳三种活性物质抗氧化功能综合对比研究还未见报道。因此试验以DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、总还原能力为参考指标对红松壳多酚、黄酮和多糖的抗氧化活性进行对比评价。
2.2.1 DPPH·自由基清除能力的测定
DPPH·是一种比较稳定的非生理自由基，能够被具有抗氧能力的物质清除，清除率越大表明抗氧化能力越强，因此经常用于定量衡量活性物质或食品的抗氧化能力。本试验以Vc作阳性对照，综合测定并比较了红松壳中多酚、黄酮和多糖对 DPPH·的清除能力，试验结果如图2。
图2 3种活性物质对DPPH清除能力
Fig.2 The DPPH scavenging ability of three active substances
从图2中可以看出，红松壳中多酚、黄酮和多糖与Vc一样，均对DPPH·有显著清除能力，且存在着量效关系。随着红松壳中多酚、黄酮、多糖与Vc浓度的增加，DPPH·的清除率显著升高，当浓度达到15 μg/mL时，对 DPPH·的清除率趋于平缓，最高值可达到93%左右。从图2中还可以看出，在相同浓度下，黄酮和多酚对 DPPH·清除率高于多糖和 Vc，初步说明红松壳黄酮和多酚具有较好的抗氧能力，多糖浓度在50 μg/mL时，清除率也可达到85%以上[21]。其中红松壳多酚清除 DPPH·的 IC50为 22.16±0.38 μg/mL，而红松壳黄酮清除 DPPH·的 IC50为25.24±0.05 μg/mL，进一步说明松壳多酚具有较强清除 DPPH·的能力，在张根生[22]等研究松仁红衣多酚对 DPPH·清除率最大可达到 93.23%，与本实验结果相似。
2.2.2 ·OH自由基清除能力的测定
·OH是一种较活泼的活性分子，具有极强的得电子能力，能与大多数物质发生氧化反应，抗氧化剂能有效地清除或减少羟自由基的产生量，从而抑制氧化的发生。本文测定多酚、黄酮、多糖三种活性物质的·OH清除能力，并对其抗氧化能力进行比较，结果见图3。
图3 3种活性物质对·OH清除能力
Fig.3 The ·OH scavenging ability of three active substances
图3结果显示，在试验浓度范围内，随着3种活性物质及阳性对照Vc浓度的增大，对·OH的清除能力也显著增强，多酚、黄酮和多糖清除羟自由基的能力小于同浓度的阳性对照[23]。当物质浓度达到 35 μg/mL，多酚和黄酮的清除率达到 65%左右，随后清除率增加变化缓慢且趋于平缓[24]。从图3可知，在50 μg/mL时，各物质对·OH的清除率均达到最大值，其中多酚对羟基自由基的清除率达到 71.21%，IC50为23.12±0.04 μg/mL，Vc对羟基自由基的的清除率达到90.35%，Vc的IC50为22.75±0.11 μg/mL，由此可见，多酚对于羟基自由基的清除效果与抗氧化剂Vc的清除效果接近，可进一步说明3种活性物质中多酚清除羟基自由基的能力最强，能够有效的清除自由基[25]。
2.2.3 总还原能力的测定
抗氧化剂是通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基，供电子能力越强，还原力越强，则抗氧化能力越强。因此可以通过测定其总还原力，评价多酚、黄酮和多糖的抗氧化能力，结果见图4。
图4 3种活性物质总还原能力
Fig.4 The total reducing power of 3 active substances
从图 4中可以看出，红松多酚、黄酮、多糖和Vc的还原能力与浓度之间均呈现一定的量效关系。试验浓度范围内，随着活性物质浓度的增加，总还原力显著升高。在0～20 μg/mL范围内，多糖的总还原能力大于多酚，但其两者均小于抗氧化剂 Vc。当活性物质浓度在40～50 μg/mL时，相同浓度下，多酚的总还原力最强，OD值可达到 0.6左右，IC50为23.54±0.06 μg/mL。黄酮次之，IC50 为 27.46±0.09μg/mL。多糖最弱 IC50为 29.48±0.13 μg/mL。综上结果红松壳多酚具有明显的还原能力，与活性物质浓度呈良好的相关性，并且其Vc的还原能力最为接近，可作为一种抗氧化能力较稳定的天然抗氧化剂[26]。
红松壳的抗氧化能力与多酚、黄酮和多糖3种活性成分之间的相关性见表1。
表1 抗氧化能力与抗氧化物质含量的相关性
Table 1 Correlation between antioxidant capacity and antioxidant content
注：*，显著相关（p＜0.05）；**，极显著相关（p＜0.01）。
DPPH·清除能力 OH·清除能力 总还原能力多酚 0.908** 0.989** 0.989**黄酮 0.797* 0.865** 0.860**多糖 0.492 0.946** 0.961**
由表1可知，多酚含量与DPPH·清除能力、·OH清除能力、总还原能力之间存在极显著相关性，相关系数分别为 0.908、0.989、0.989（p＜0.01）；酚羟基作为氢的供体，与氧化过程中产生的自由基相结合，通过电子转移将DPPH·清除，与Fe2+螯合，阻止Fe2+催化生成·OH的反应而将羟自由基清除终止氧化过程的进行。由此说明多酚中提供电子的物质与多酚的含量有良好的量效关系。而与黄酮含量相关性较弱，黄酮含量仅与·OH清除能力和总还原能力之间具有显著相关，相关系数分别为 0.865、0.860（p＜0.01），与DPPH·清除能力相关系数为 0.797（p＜0.05）显著相关，可能与其在红松壳中含量较少有关，而一些黄酮化合物易与糖类结合形成糖苷，减少与自由基的结合。多糖虽是3种活性成分中含量最高的物质，但与DPPH·清除能力无显著相关性（p＞0.05），与·OH 清除能力和总还原能力存在极显著相关，相关系数分别为0.946、0.961（p＜0.01）。通过分析上述结果可知，多酚与3种测定抗氧化方法的相关系数最大，说明多酚含量与抗氧化能力之间的相关性最强，可推断多酚是发挥抗氧化功能的重要物质[27]。
本论文使用不同浓度乙醇溶剂提取红松壳中主要活性成分并分析其含量，同时测定抗氧化活性分析活性成分与抗氧化功能之间的相关性。结果表明乙醇浓度对提取红松壳中活性成分含量存在显著差异，在40%的乙醇浓度下，3种活性成分均可达到最佳提取率，分别为4.05 mg/g、1.7 mg/g和7.05 mg/g。多酚的抗氧化能力最强与抗氧化剂Vc的抗氧化活性基本一致，其中DPPH·清除能力、·OH清除能力及总还原能力的 IC50分别为 0.20±0.05、13.04±0.04、40.15±0.06 μg/mL，显著高于黄酮、多糖这两种活性成分。相关性分析结果也表明松壳多酚与抗氧化活性相关性最高，其中松壳多酚与 DPPH·相关性是 0.908，与·OH相关性是 0.989，与总还原力相关性是 0.989（p＜0.01）。综上所述，红松壳多酚可作为一种安全的天然抗氧化物来源，在食品、药品方面具有较高的应用价值和潜在效益，为红松壳多酚资源的综合利用提供理论依据。
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Study on the Correlation between Contents of Polyphenols, Flavonoids,Polysaccharides in Pinus koraiensis Seed Putamina and Their Antioxidant Activities
Abstract: In order to investigate the correlation between contents of major active ingredients in Pinus koraiensis seed putamina and its antioxidant activity, Yichun Pinus koraiensis seed putamina was used as raw material in this study to extract polyphenols, flavonoids and polysaccharides by different ethanol concentrations. The correlation between active ingredients in Pinus koraiensis seed putamina and their antioxidant activities were analyzed by SPSS statistical analysis software. The results showed that when the concentration of ethanol was 40%,the highest yields of polyphenols, flavonoids and polysaccharides in Pinus koraiensis seed putamina were 4.05 mg/g, 1.7 mg/g and 7.05 mg/g,respectively. Antioxidant activity test showed that antioxidant activity of polyphenols from Pinus koraiensis seed putamina was significantly higher than that of flavonoids and polysaccharides, which was comparable to that of Vc. The IC50 (half clearance concentration) values of polyphenols from Pinus koraiensis seed putamina on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl radical (·OH) and the total reducing power were 0.20±0.05 μg/mL, 13.04±0.04 μg/mL and 40.15±0.06 μg/mL, respectively. The correlation analysis showed that the correlation between the polyphenols from Pinus koraiensis seed putamina and the antioxidant activity was the highest, and the correlations between the polyphenols from Pinus koraiensis seed putamina and DPPH,·OH as well as the total reducing power were 0.908, 0.989 and 0.989 (p＜0.01),respectively. It could be seen that polyphenols from Pinus koraiensis seed putamina were the main antioxidant components. The results of this study provided a scientific basis for the comprehensive utilization of the by-products of the Yichun Pinus koraiensis seed putamina and the development of natural antioxidants.
Key words: Pinus koraiensis seed putamina; polyphenols; flavonoids; polysaccharides; antioxidant
收稿日期：2017-07-24
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助（2572014EA02、2572014CA19）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C2015062）
文章篇号：1673-9078(2017)12-44-49
DOI： 10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.12.007