图1 芦丁和胺类衍生反应的紫外光谱扫描
Fig.1 UV scanning spectrum of derivatization reaction of rutin and amine
注：a，芦丁；b，二甲胺和芦丁的衍生物；c，二乙胺和芦丁的衍生物；d，二正丙胺和芦丁的衍生物；e，二正丁胺和芦丁的衍生物；f，二正戊胺和芦丁的衍生物。
摘要：建立了芦丁的毛细管电泳电化学发光（CE-ECL）快速分离检测方法。将芦丁与五种仲胺进行衍生反应得到叔胺类化合物，先进行紫外扫描筛选，再将进行CE-ECL检测。银杏叶样品采用70%乙醇水溶液超声波辅助提取。考察检测电位、检测池缓冲液和运行缓冲液的浓度和pH值、进样电压、分离电压和时间等因素对芦丁分离检测的影响。在最佳实验条件下，芦丁在5 min内实现分离。该方法的线性范围为0.002～2 μg/mL，回归方程为y=1958.4x+7600.4，相关系数为0.994，检出限为0.0004 μg/mL。对0.2 μg/mL芦丁标准溶液衍生物进行7次检测，其迁移时间、峰高和峰面积的RSD分别为1.1%、1.2%和2.0%。此方法应用于银杏叶中芦丁的检测，加标回收率在92%～103%之间。
关键词：毛细管电泳电化学发光（CE-ECL）；银杏叶芦丁；衍生法；叔胺类化合物
银杏（Ginkgo biloba L.）是银杏科、银杏属落叶乔木，有植物“活化石”之称。据现代药理研究，银杏叶中的活性成分黄酮具有改善记忆力和脑功能、改善心血管和心肌缺血的功效[1,2]。芦丁（Rutin）属于黄酮类化合物，在银杏叶中的含量很高，有相关研究表明，芦丁具有较强的抗癌活性，对急性脑梗死和新生儿缺氧缺血性脑病等脑病的治疗效果显著且具有较高的安全性[3～6]。目前，银杏叶中芦丁的分析方法主要有紫外分光光度法[7]、薄层色谱法（TLC）、荧光法[8]、循环伏安法（CV）[9]、毛细管电泳法（CE）[10,11]、电化学分析法[12,13]和高效液相色谱法（HPLC）[14,15]等，其中，紫外分光光度法和薄层色谱法精密度较低，高效液相色谱法操作自动化，重现性好，但是设备复杂，检测时间长，成本高。
毛细管电泳电化学发光技术（CE-ECL）具有高效（分辨率、分析速度和灵敏度）、选择性好、所需样品少、仪器简单小型化、成本低廉和应用范围广泛等特点。联吡啶钌（Ru(bpy)32+）电化学发光是一种技术简单、线性范围宽、分析控制性强、灵敏度很高的检测手法，检测中无须添加外来光源和分光系统，可避免散杂光和光源不固定的影响[16]。Ru(bpy)32+和CE-ECL结合起来，是一种非常具有应用潜能的分析技术。近年来，毛细管电泳电化学发光技术已被广泛应用于胺类药物[17～22]、氨基酸类[23]、草酸盐类[24]、农残[25,26]和生物碱[27,28]等物质的研究。这些被分析的物质均含有含氮基团，能和 Ru(bpy)32+发生反应产生较强的发光信号而被分析检测。有研究报道[29]，Ru(bpy)32+的ECL对胺类物质具有极强的选择性，且胺本身的结构决定了ECL强度。由于伯胺中氨基的第一级电离化所需能量依次大于仲胺和叔胺，故使得ECL发光强度为伯胺＜仲胺＜叔胺。目前，使用CE-ECL技术分析芦丁的文献尚未见报道，而毛细管电泳电化学（CE-ED）方法的研究报道相对多些[30]。对于CE-ECL分析技术的发光机制，三丙胺因其较高的发光效率而成为研究最多的一种[31]，且已作为一种共反应物，运用广泛。但是将该方法应用到芦丁的分析中并未取得良好的效果，且未见报道。因此，可根据芦丁的理化性质，通过衍生反应引入含氮基团，将芦丁衍生为叔胺类化合物，采用毛细管电泳电化学发光技术，建立一种高效、快速及准确的分析芦丁的方法。
MPI-B型多参数化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）；KQ 5200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-20M离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；ZT-1000A型高度多功能粉碎机（永康市展帆工贸有限公司）；EL20实验室 PH 计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Millipore超纯水机（美国，Millipore公司）；未涂层的熔融石英毛细管（50 cm×25 μm i.d.）；CE及ECL检测采用三电极系统：工作电极是直径500 μm的铂丝电极，参比电极是直径300 μm的Ag/AgCl电极（饱和KCl溶液），辅助电极为直径1 mm的铂电极（西安瑞迈分析仪器有限公司）；0.22 μm的尼龙纤维素膜（津隆）。
芦丁标品（HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；联吡啶钌（Ru(bpy)3Cl2·6H2O，99.95%，美国Sigma-Aldrich公司）；二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二正丁胺、二正戊胺（99.5%，Amethyst Chemicals）；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
银杏叶于2016年11月中旬采收于陕西理工大学校园，采收树为3年生银杏雌树，采集30片银杏叶，于45 ℃烘箱中烘24 h，粉碎，过60目筛，密封保存于自然袋中，置于干燥器中备用。
1.2.1 标准品溶液的配置
芦丁标准溶液：准确称量芦丁标准品2.0 mg，先取适量95%乙醇溶解，再定容至100 mL容量瓶中，即可得浓度为0.02 mg/mL的芦丁标准溶液。
1.2.2 样品溶液的制备
称取1.0 g银杏叶干粉于25 mL 70%乙醇水溶液中，利用超声波辅助[32]（提取功率80 W，时间40 min，温度70 ℃）提取银杏叶中的黄酮芦丁，然后离心（4 ℃4000 r/min）10 min，收集上清液，并用70%乙醇水溶液定容至25 mL容量瓶，用0.22 μm滤膜过滤，置于4 ℃冰箱中冷藏备用。
选取二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二正丁胺和二正戊胺等五种胺类作为衍生试剂。在2500 μL的醋酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 4.5）中，加入芦丁80 μL，二甲胺或二乙胺或二正丙胺或二正丁胺或二正戊胺加入250 μL，摇匀后，静置3 min，反应完全，备用。
选取内径为 25 μm×50 cm 未涂层溶融石英毛细管。试验前对毛细管进行处理。首次使用毛细管前先用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h进行活化，每天试验前需依次用0.1 mol/L NaOH、超纯水压力冲洗10 min，再用分离缓冲液平衡10 min以上。
工作电极为铂丝电极，长期使用2～3个月，当铂丝电极发黑以后，需用金相砂纸打磨后再用粒径0.05金相的氧化铝粉末在绒布上抛光平整，达到镜面效果，再使用超纯水超声清洗 8 min，晾干后使用。参比电极为Ag/AgCl电极，当发现有沉淀时，需要及时更换。利用光学显微镜观察，使工作电极与毛细管出口对齐，并调整两者之间的距离为100 μm。
检测池内为300 μL的检测液（50 mM，pH 7.8硼酸盐缓冲液，5 mM Ru(bpy)32+），运行缓冲液为硼酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.8）。光电倍增管高压设为800 V。所有样品进入毛细管前均需用0.22 μm的尼龙纤维素膜过滤。毛细管进样端插入缓冲液中，进行循环伏安法扫描至发光信号基线稳定后，选择恒电位法进样检测。记录其CE-ECL图谱，以相对峰高定量。
图1 芦丁和胺类衍生反应的紫外光谱扫描
Fig.1 UV scanning spectrum of derivatization reaction of rutin and amine
注：a，芦丁；b，二甲胺和芦丁的衍生物；c，二乙胺和芦丁的衍生物；d，二正丙胺和芦丁的衍生物；e，二正丁胺和芦丁的衍生物；f，二正戊胺和芦丁的衍生物。
图2 五种仲胺与芦丁的电化学发光强度
Fig.2 Electrochemical luminescence intensity of five secondary amines and rutin
通过五种仲胺与芦丁标品的衍生反应，可明显观察到颜色由浅变深。五种仲胺的紫外光谱扫描均无峰值，衍生物的紫外扫描图谱如图 1，可得芦丁与五种仲胺均发生反应，其中a为芦丁标品在波长354 nm处出峰；b、f在同一波长处出峰，但吸光度明显下降，原因是芦丁与二甲胺、二正戊胺反应体系中芦丁过量；c、d、e中反应物最大吸收波长发生变化，是芦丁与二乙胺、二正丙胺、二正丁胺反应完全，结构式中碳氧双键打开，能量衰减，跃迁吸收带向长波方向移动，即红移。图2为五种仲胺与芦丁衍生后的电化学发光强度，由图可知二乙胺和二正丙胺的ECL强度最高。
图3 芦丁和二正丙胺的衍生机理
Fig.3 Derivative mechanism of rutin and di-n-propylamine
本研究选择二正丙胺作为衍生试剂，进行芦丁的毛细管电泳电化学发光分析方法建立。其反应机理如图 3，芦丁分子结构中含有一个不饱和碳氧双键，在酸性条件下，能与仲胺发生亲核加成反应，脱水生成叔胺类化合物，同时可知该反应结果单一，无同分异构体，大大提高了检测结果的准确性，其他衍生反应均遵循此机理，不再附图。
毛细管电泳电化学发光参数为：300 μL的检测液（50 mM，pH 7.8硼酸盐缓冲液，5 mM Ru(bpy)32+），运行缓冲液为硼酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.8）。光电倍增管高压设为800 V。检测电位1.21 V，进样高压10 kV，分离高压15 kV，分离时间10 s。
图4 芦丁、二正丙胺与芦丁反应衍生物的毛细管电泳图
Fig.4 Capillary electrophoresis gram of rutin, derivatives reacted by rutin and di-n-propylamine
注：1表示二正丙胺与芦丁反应衍生物；2表示芦丁。
通过电化学发光实验对二正丙胺和芦丁衍生生成的叔胺化合物与 Ru(bpy)32+作用的电化学发光行为进行研究。分别对含10 μg/mL芦丁、5 mM Ru(bpy)32+的50 mM，pH 7.8的硼酸盐缓冲液和含二正丙胺与芦丁反应衍生物、5 mM Ru(bpy)32+的50 mM，pH 7.8的硼酸盐缓冲液进行化学发光检测，记录其电化学发光曲线（如图4）。结果表明，芦丁本身没有发光强度，而与二正丙胺反应后的芦丁衍生物有较强的发光信号。这是由于芦丁中含有羰基，会与二正丙胺发生反应生成叔胺类物质，达到明显的增敏作用，从而可以利用CE-ECL对其进行检测分析。
图5 芦丁与二正丙胺反应衍生物的循环伏安图
Fig.5 Cyclic voltammograms of derivatives reacted by rutin and di-n-propylamine
检测电位是影响光信号强度的决定性因素之一。试验中采用恒电位法研究测电位对芦丁衍生物电化学发光信号的影响。在1.05～1.40 V范围内考察ECL强度的变化趋势，试验条件为5 mM的钌联吡啶（溶于pH 7.8硼酸盐缓冲液），分离电压15 kV，运行电压12 kV，固定其他参数不变，以芦丁标准溶液的衍生物进行检测电位的优化。结果表明，在1.05 V～1.21 V之间，ECL强度随着检测电位的增大而增大，超过1.21 V时，光强反而减小了，故将1.21 V选作实验最优检测电位。
研究运行缓冲液浓度对ECL强度的影响，在最佳检测电位1.21 V下，其他条件不变，研究25 mM～150 mM硼酸盐缓冲液浓度对ECL强度的变化影响。实验表明，在5 mM Ru(bpy)32+，50 mM硼酸盐缓冲液下，芦丁衍生物有满意的发光强度和信噪比。
电化学发光试剂 Ru(bpy)32+在和样品反应的过程中与脱质子化紧密相关[33]，所以检测池中硼酸盐缓冲液的pH会很大程度上影响ECL强度。固定检测池缓冲液的浓度为50 mM，在pH 7.4～9.0范围内考察了检测池缓冲液pH对ECL强度的影响。结果表明，pH 7.8时，电化学发光强度最大，故选择7.8为最佳pH值。
控制硼酸盐缓冲液的pH为7.8，在浓度为4～24 mM范围内研究了其对ECL强度的影响。实验表明：当缓冲液的浓度为8 mM时，ECL强度达到最大，故选择硼酸盐缓冲液的最佳浓度为8 mM。固定其浓度为8 mM，当硼酸盐缓冲液的pH在7.4～7.8范围内变化时，ECL强度随pH的增大而增大，在7.8～9.0变化时，ECL强度随pH的增大而减小。故选择pH=7.8，浓度为8 mM的硼酸盐缓冲液。
分离电压主要影响样品的迁移时间和分离效率。本实验研究了分离高压在9～19 kV内对样品迁移时间和分离的影响。综合考虑迁移时间、峰展宽、分离效率、灵敏度、噪音和焦耳热等因素，确定最佳分离电压为15 kV。
进样电压和时间决定着样品进样量的大小，进而影响电化学发光强度和分离效率。芦丁衍生物进样方式采用的是电动进样，控制进样时间为10 s，在6～16 kV范围内改变进样电压。实验结果表明，进样电压在6～12 kV时，ECL强度随着进样电压的增大而增大，在12～16 kV时，ECL强度反而随着进样电压的增大而减小，而且峰展宽严重，柱效降低。所以选择12 kV作为最佳进样电压。固定进样电压12 kV，考察不同进样时间对ECL强度、迁移时间和峰形的影响。实验得知，随着进样时间的增大，ECL强度增大，但迁移时间延长、峰形变宽。所以选择最佳进样时间为10 s。
在最佳检测条件下，测定系列不同浓度的芦丁标准溶液衍生物，并绘制标准曲线。芦丁标准溶液衍生物在0.002～2 μg/mL浓度范围内与ECL强度呈线性关系，其线性方程为y=1958.4x+7600.4（r=0.994），检出限（S/N=3）为 0.0004 μg/mL。
对0.2 μg/mL芦丁标准溶液衍生物进行7次检测，得到其迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.1%、1.2%和2.0%，表明该检测方法的精密度良好。
采用所建立的方法，测得银杏叶提取物中芦丁含量为0.049 μg/mL，样品和标准品的毛细管电泳电化学发光图如图6所示，芦丁衍生物在5 min内得以分离。对已知的银杏叶提取物中芦丁含量进行加标回收试验，采用已建立的方法进行分析，其平均回收率为97.4%，RSD为3.5%，结果见表1。
表1 银杏叶中芦丁的测定及加标回收率
Table 1 Determination and recoveries of Rutin in the Ginkgo leaf (n=5)
样品含量ω/(μ g/m L) 加标量ω/(μ g/m L) 测得值ω/(μ g/m L) 回收率/% 平均回收率/% R S D/%0.0 6 8 4 9 7 0.0 4 9 0.0 2 0.0 6 9 6 1 0 3 0.0 6 8 6 9 8 0.0 6 8 4 9 7 0.0 6 7 4 9 2 9 7.4 3.5
图6 样品和标准品的CE-ECL图谱
Fig.6 CE-ECL electropherograms of rutin standards and sample
注：1表示芦丁标准品的衍生物；2表示银杏叶样品。
由于芦丁结构式不含叔胺基官能团，因此本工作选择五种胺类作为衍生试剂，与芦丁进行衍生反应生成含有叔胺基团的化合物，通过紫外检测得到五种仲胺均有增强 Ru(bpy)32+发光强度的作用，其中以二乙胺和二正丙胺增加发光强度的作用最强。本研究选择二正丙胺作为衍生试剂进行方法建立。在1.21 V检测电位、5 mM Ru(bpy)32+，50 mM（pH 7.8）检测池缓冲液、8 mM（pH 7.8）的运行缓冲液、分离电压15 kV、运行电压12 kV、运行时间10 s的条件下，建立了芦丁的毛细管电泳电化学发光检测方法，并用来分析银杏叶中芦丁的含量，其线性范围宽，检出限低于高效液相色谱法[34]。同时还具有快速准确、灵敏度高、操作简单及所需试剂量少等优点。
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Determination of Rutin in Ginkgo leaf by Capillary Electrophoresis-Electrochemiluminescence
Abstract: A rapid and efficient separation method was established for the determination of rutin by capillary electrophoresiselectrochemiluminescence (CE-ECL). Tertiary amine compounds, obtained by derivatization reaction of rutin and five secondary amines, were screened by UV, and then detected by CE-ECL. Ginkgo leaf samples were extracted with 70% ethanol aqueous solution by ultrasonic-assisted extraction. The influences of detection potential, concentration and pH of separation buffer and running buffer, separation voltage, injection voltage and injection time on the separation and detection of rutin were investigated. Under the optimal conditions, rutin was separated in 5 minutes, and the linear concentration range for rutin was 0.002～2 μg/mL. Besides, the regression equation was y=1958.4x+7600.4, with a correlation coefficient of 0. 994 and a detection limit of 0.0004 μg/mL (S/N=3). The relative standard deviations (RSD) of migration time, peak height and peak area for seven continuous injections of 0.2 μg/mL rutin were 1.1%, 1.2% and 2.0%, respectively. The proposed method was applied to the determination of the rutin in Ginkgo leaf with the recoveries of 92% -103%.
Key words: capillary electrophoresis-electrochemiluminescence (CE-ECL); rutin in Ginkgo leaf; derivative; tertiary amine compounds
文章篇号：1673-9078(2017)11-257-263
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.11.037
收稿日期：2017-05-09
基金项目：陕西省科技厅农业科技创新与攻关项目（2015NY130）；陕西理工大学研究生创新基金项目（SLGYCX1623）；陕西理工大学博士后专项项目（SLGBH16-01）