玉米（Zea mays L.）是禾本科玉蜀黍植物，其产量高、适应性强，是我国主要粮食作物之一[1]。玉米籽粒富含蛋白质、脂肪、维生素和类胡萝卜素等营养物质，适用于三高人群，是人们膳食粮谷的优质来源[2]。类胡萝卜素(Carotenoids)是玉米籽粒中重要的营养物质，其中叶黄素和玉米黄质是人眼视网膜中的主要色素，具有强抗氧化作用，可淬灭活性自由基和单线态氧，有效降低眼部疾病风险[3]。此外，类胡萝卜素还可增强人体免疫力，预防心血管疾病，防癌抗癌、辅助治疗多种疾病等生理功能[4]。玉米等谷物籽粒发芽后，内源酶被激活，其化学物质的组成结构及含量发生了改变，提高了营养品质，同时增加了人体对其的吸收利用率[5]。
高等植物体内类胡萝卜素合成途径是由合成前体物质牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸通过八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)和 ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)依次催化转化为番茄红素。再经番茄红素 β-环化酶(lycopene β-cyclase，LCYB)和番茄红素 ε-环化酶(lycopene ε-cyclase，LCYE)、胡萝卜素 ε环羟化酶(cytochrome P450 hydroxylases CYP97C)和胡萝卜素 β 环羟化酶(carotene β-hydroxylase BCH1)催化最终合成叶黄素(lutein)和玉米黄质(zeaxanthin)[6]。通常逆境胁迫，如光照、温度和渗透压胁迫会对植物生长产生不利影响，但能诱导类胡萝卜素和酚类物质等次生代谢物的富集，有助于提高植物作物的营养价值，并增强其抗氧化能力[7]。荞麦种子在 50 mmol/L NaCl胁迫下发芽 7 d，其总类胡萝卜素含量是对照的2倍，DPPH清除能力比对照增加了约40%[8]；Abdallah等人[9]将龙葵种子发芽后施加 100 mmol/L NaCl，其叶黄素含量比对照增加了35%；Aliu等人[10]研究4个不同品种玉米籽粒发芽后施加100 mmol/L NaCl，其类胡萝卜素含量分别比对照提高了10%～48%。综上，NaCl胁迫是植物籽粒发芽富集其植物营养素等活性物质的一种有效方式。
本试验以黄色玉米‘苏玉-29’籽粒为材料，研究不同浓度NaCl溶液处理后，发芽玉米籽粒的生长状况，类胡萝卜素含量和抗氧化能力，以及其合成途径中关键酶基因相对表达量的变化规律。旨在为探索利用NaCl胁迫处理对发芽玉米籽粒富集类胡萝卜素提供理论依据，为以黄色玉米籽粒为原料富集类胡萝卜素开创新思路和方法，同时玉米籽粒的营养价值和生物利用率的提高，为生产富含类胡萝卜素的发芽玉米及其增值功能性食品开发提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试玉米品种为‘苏玉-29’（SY-29），购于江苏省农业科学院六合动物科学试验基地，选取大小均一、无病虫害、无损伤的成熟玉米籽粒为试验材料，封装于密封袋中，4 ℃保存备用。
类胡萝卜素标准品（纯度＞90%），购于美国Sigma公司；色谱级甲醇、甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether，MTBE)，购自美国Tedia公司；黄嘌呤氧化酶，购于南京建成生物研究所；分析纯6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman- 2-carboxylic acid，Trolox)，购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；分析纯2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二 盐 酸 盐 (2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide ，dihydrochloride，AAPH)，购于阿拉丁（上海）有限公司；分析纯正己烷、丙酮、甲苯、盐酸羟胺、愈创木酚、荧光素钠、无水乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钾等，购于国药集团化学试剂有限公司；Plant RNA Extraction Kit、RT-PCR Mater Mix Kit、SYBR Premix Ex Taq，购于 Takara公司。
1.2 仪器与设备
安捷伦1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；微孔板分光光度计，BioTek Instruments；TriStar LB-941型微孔板多功能分析仪，德国Berthold Technologies（伯托）公司；荧光定量 PCR仪 Light Cycler 480 II，德国 Roche公司；BS224S 电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器公司；紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FD-1A-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发器和 B-220恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵，上海东玺制冷仪器设备有限公司；D10氮气吹扫仪，杭州奥盛仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发芽实验设计
经筛选、除杂后，选取成熟饱满、大小均一的玉米籽粒。用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡消毒25 min后，去离子水冲洗数次至pH中性。常温下预处理浸泡16 h（每浸泡7 h断水1 h，连续浸泡2次）后，用不同浓 度NaCl溶液浸泡玉米籽粒8 h，试验中NaCl溶液设定5个浓度水平，分别为0（CK）、150、300、450、600 mmol/L。浸泡后将玉米籽粒表面洗净后，放入垫有双层滤纸的培养皿（Ф15 cm）中，每皿30 g左右，于25 ℃恒温培养箱内黑暗条件下发芽，每隔4 h喷水一次保湿。发芽3 d后，记录发芽数用于统计发芽率。用吸水纸吸干表面水分，鲜样用于测定芽长、呼吸强度、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性。冷冻干燥后的样品经研磨粉碎，过60目筛后测定类胡萝卜素含量和总抗 氧 化 能 力 指 数 (Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC)。
1.3.2 生长状况指标测定
发芽率：参照国家标准GB 3543-83《农作物种子检验规程》[11]中试验方法，以突破种皮的胚轴长度达2 mm为发芽标准，记录发芽玉米种粒，计算发芽率；胚芽长：随机取10粒发芽玉米籽粒，用游标卡尺测定，取平均值；呼吸强度：用小篮子法[12]测定。
1.3.3 类胡萝卜素的提取
参考Kao等人[13]的方法，并略作改进。准确称取3.0 g发芽玉米籽粒粉末置于磨口锥形瓶中，加入30 mL正己烷-乙醇-丙酮-甲苯（10:6:7:7，V/V）混合萃取液。静置 3～4 h 后，加入 2 mL 40% KOH-甲醇溶液摇匀后置于暗处25 ℃皂化16 h。将皂化液转入250 mL分液漏斗，加40 mL正己烷，振荡摇匀，再加入48 mL 10%硫酸钠溶液，充分摇匀混合液体后，静置，弃去下层液体，收集上层溶液。上述处理重复2次，混合收集的上层溶液于100 mL圆底烧瓶中，进行旋转蒸发，待溶剂蒸发完全后，用少量正己烷溶解后，将溶液转移至试管中，再用氮气将溶剂吹干。用2 mL色谱级甲醇复溶，经0.22 μm的有机膜过滤后转入棕色液相小瓶中，待测定分析。
1.3.4 类胡萝卜素含量的测定
类胡萝卜素含量测定采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)法，HPLC条件参照 Li等[14]的方法。色谱柱为 YMC-C30（4.6 nm×250 nm，5 μm）色谱柱，柱温为25 ℃，进样量为20 μL，检测器为二极管阵列检测器(Diode array detector，DAD)，波长为 450 nm。流动相：A 相为水:MTBE:甲醇=5:25:75（V∶V∶V），B 相为水:MTBE:甲醇=5:85:10（V∶V∶V）。线性梯度洗脱，流速为 0.6 mL/min，梯度洗脱程序：0 min：95% A，4.5 min：80% A，12.5 min：50% A，18 min：25% A，24～30 min：5% A。
1.3.5 抗氧化活性测定
SOD 和POD 酶提取液包括50 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/L二硫苏糖醇和 1%聚乙烯吡咯烷酮。将发芽玉米籽粒鲜样和酶提取液按质量体积比1:5于冰浴中研磨，得到混合溶液于10,000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶提取液。
SOD活性测定参照徐东[15]的方法并加以改进，1 mL 66.7 mmol/L pH 7.8 磷酸缓冲液，加入粗酶液 50 μL，依次加入 100 μL 10 mmol/L 盐酸羟胺、200 μL 7.5 mol/L 黄嘌呤、200 μL 0.2 mg/mL 黄嘌呤氧化酶、490 μL 双蒸水，混匀后于37 ℃静置30 min，再加入2 mL 0.33%对氨基苯磺酸、2 mL 0.1%甲萘胺，室温放置10 min，在550 nm波长下测定OD值。酶活性单位（U）定义为1 g鲜样在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所需要的酶量。
POD活性测定采用愈创木酚氧化法[16]，取2.9 mL 0.05 mol/L pH 6.5 磷酸缓冲液、1 mL 2% H2O2、1 mL 0.5 mol/L愈创木酚，加入100 μL粗酶提取液启动反应，每隔30 s记录OD470 nm，共计5次。酶活性单位（U）为 1 g 鲜样 1 min 内 OD470 nm降低 0.01 单位所需要的酶量。
ORAC 值测定参照 Paula Becker Pertuzatti[17]的方法并加以改进，准确称取1 g发芽玉米籽粒粉末，用85%甲醇（含0.5%甲酸）超声提取3次，提取溶剂体积分别为10、10、5 mL，每次提取条件为室温下超声20 min，5000 r/min 离心 10 min，合并 3 次提取上清液待测。用85%甲醇（0.5%甲酸）将上清液稀释400倍，取 100 μL 稀释液加入50 μL 荧光素钠，37 ℃反应 30 min后，加入50 μL AAPH一起置于微量培养板上。将平板在自动酶标仪中于37 ℃温育，并使用荧光检测器每分钟读取一次，共读取100 min，激发波长为485 nm，发射频率为535 nm。使用Trolox绘制标准曲线，结果表示为Trolox/g DW。
1.3.6 基因表达
取发芽3 d的玉米籽粒，参照RNA提取试剂盒(Takara)的说明书提取发芽玉米籽粒的总RNA。
根据 NCBI上公布的 cDNA序列，采用 Primer Primier 5.0引物设计软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，如下表1所示。
荧光定量 PCR 采用 SYBR Premix Ex Taq (Takara)试剂盒，以玉米 ACTIN基因作为内参基因，并采用20 μL 反应体系。
表1 玉米类胡萝卜素合成相关酶基因引物序列
Table 1 The primer sequence of carotenoids synthesis genes in corn kernels
基因 引物序列(5’-3’) 上游引物 下游引物 PSY CATCTTCAAAGGGGTCGTCA CAGGATCTGCCTGTACAACA PDS GAAATCATCGATGCAACTATGGAA CTTCGATAGGTGACCTTTGGA ZDS GTGTGGTAAAGATCGGACAA AGAGAGTTGCTCCTTCCAT LCYB CATCGTAAGGTTCCTCGACA ATGCCGAAGCAGAAGAACTC LCYE TTTACGTGCAAATGCAGTCAA TGACTCTGAAGCTAGAGAAAG BCH1 CCACGACCAGAACCTCCAGA CATGGCACCAGACATCTCCA CYP97C GTTGACATTGGATGTGATTGG AACCAACCTTCCAGTATGGC ACTIN CGATTGAGCATGGCATTGT CCCACTAGCGTACAACGAA
表2 不同浓度NaCl胁迫对发芽3 d的玉米籽粒生理指标的影响
Table 2 Effects of different concentrations of NaCl stress on physiological and biochemical indexes of germinated corn at 3 d
注：不同小写字母表示各处理组间理化指标差异显著（p＜0.05）。
理化指标 NaCl溶液浓度/(mmol/L) 0 150 300 450 600 发芽率/% 80.50±0.07e 65.50±0.14d 57.50±0.20c 48.00±0.40b 45.50±0.06a 胚芽长度/cm 2.67±0.07d 2.01±0.05c 1.97±0.03c 1.60±0.06b 1.17±0.07a 呼吸强度/(g CO2/g/h FW) 0.59±0.10a 0.99±0.12b 1.26±0.11c 1.11±0.08bc 0.94±0.14b
1.4 数据统计及分析
试验设置3次生物学重复，各指标测定设置3次技术重复，试验数据用SPSS 19.0软件统计分析，单项方差分析法(ANOVA)进行多重比较，判断显著性差异的统计标准为p＜0.05，极显著差异的标准为p＜0.01。ORAC 值用 GraphPad. Prism. V6. 01 软件计算分析。图和表采用OriginPro 8.5 软件绘制。
2 结果与讨论
2.1 NaCl胁迫对玉米籽粒生长状况的影响
图1 不同浓度NaCl处理下发芽玉米籽粒3 d的生长情况
Fig.1 Growth of germinated corn kernels treated with different concentrations of NaCl at 3 d
本试验采用不同浓度 NaCl预处理玉米籽粒，发芽3 d的生长状态如图1所示。结果表明，在0～600 mmol/L NaCl胁迫下，随NaCl浓度增加，玉米籽粒的发芽率和芽长均呈下降趋势。
由表2可知，不同浓度NaCl处理下，玉米籽粒发芽率和芽长与对照相比较均有显著差异（p＜0.05）。当NaCl处理浓度为600 mmol/L时，玉米籽粒发芽率和芽长受到严重抑制，分别比对照降低了 43.47%和56.18%，且其抑制程度与处理浓度呈显著正相关，相关系数分别为0.923和0.944（p＜0.01）。NaCl胁迫下，种粒外界渗透压高于内界，导致其吸水不足甚至失水，抑制种子吸收膨胀过程，不能突破种皮，从而抑制发芽[18]。金正律[19]等人研究发现盐胁迫抑制种子萌发对发芽的影响有3种可能性：阻止种子萌发，但不使其丧失活力；延迟但不阻止种子萌发；使种子永久失去活力。本试验结果表明，NaCl胁迫对玉米籽粒的发芽有显著抑制作用。这与王永娟[20]等人研究不同类型盐胁迫对玉米种子萌发特性的影响得到的结果相似。
呼吸强度反应植物的生长状态，由表2可知，不同浓度 NaCl处理下，发芽玉米籽粒呼吸强度先升高再下降，但均高于对照且呈显著差异。当 NaCl浓度为300 mmol/L时，其呼吸强度达到最大值，为1.26 g CO2/g/h，比对照提高113.56%。450 mmol/L NaCl胁迫下，其呼吸强度略低于300 mmol/L NaCl处理组，而比对照提高88.13%。在150和600 mmol/L NaCl处理下，其呼吸强度无显著差异，分别比对照提高67.79%和59.32%。NaCl胁迫下发芽玉米籽粒呼吸强度增强的主要原因是逆境条件下植物体启动自身渗透调节功能，而合成渗透调节物质会消耗大量生物能量，需通过呼吸作用产生更多的ATP为其供能，因而供试发芽玉米籽粒的呼吸强度增大[21]。
2.2 NaCl胁迫对发芽玉米籽粒中类胡萝卜素含量的影响
本研究利用C30-HPLC-DAD方法分析测定了发芽玉米籽粒中类胡萝卜素含量，图2a和2b分别是6种类胡萝卜素标准品和样品的高效液相色谱结果图。通过与类胡萝卜素标准品的保留时间比对，确定玉米籽粒样品中主要的6种类胡萝卜素分别为叶黄素、玉米黄质、α-隐黄质、β-隐黄质、α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素。
图2 6种类胡萝卜素标准品及发芽玉米籽粒中类胡萝卜素HPLC图
Fig.2 HPLC results of six kind of carotenoids standard and carotenoids in germinated corn kernels
注：1.叶黄素；2.玉米黄质；3.α-隐黄质；4.β-隐黄质；5.α-胡萝卜素；6.β-胡萝卜素。
不同浓度NaCl胁迫下，玉米籽粒发芽第3 d，6种类胡萝卜素含量随 NaCl浓度增加呈先升高后降低的趋势，单个含量从高到低依次为叶黄素＞玉米黄质＞α-隐黄质＞β-胡萝卜素＞β-隐黄质＞α-胡萝卜素。叶黄素和玉米黄质约占6种类胡萝卜素总量的84.42%，β-隐黄质、α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素含量均小于 1 μg/g。150 mmol/L NaCl处理下，6 种类胡萝卜素总量与对照组间无显著差异。当NaCl浓度为300 mmol/L时，6种类胡萝卜素总量提高到24.96 μg/g，比对照增加了21.52%（如图3所示），其中叶黄素和玉米黄质含量显著增加（p＜0.05），达到最大值13.18 μg/g 和7.89 μg/g，分别比对照提高19.49%、29.56%，其富集效果显著。当NaCl浓度继续增加450和600 mmol/L时，叶黄素含量下降，分别比300 mmol/L NaCl处理减少了18.74%和34.29%。
图3 不同浓度NaCl胁迫下发芽玉米中类胡萝卜素含量
Fig.3 Carotenoid content of germinated corn kernels under different concentrations of NaCl
注：不同小写字母表示各处理组间类胡萝卜素含量差异显著（p＜0.05）。
植物在高温、干旱和盐等非生物胁迫下会选择性地合成类胡萝卜素等萜类物质帮助其抵御胁迫[22]。梁明华等人[23]研究发现巴氏藻类在盐胁迫下可大量积累β-胡萝卜素。烟草在盐胁迫下能通过提高类胡萝卜素含量以减少活性氧的积累，保护烟草避免受到氧化压力[24]。由此可知，NaCl胁迫处理可作为提高类胡萝卜素的有效手段。试验结果表明适宜浓度的 NaCl处理玉米籽粒萌发可促进其类胡萝卜素的合成。但若NaCl处理浓度过大，胁迫程度过重，会导致发芽玉米生长受阻，也会抑制类胡萝卜素合成。史利平等[25]人研究发现，不同浓度的NaCl（0、100、200、400 mmol/L）处理玉米幼苗后，其类胡萝卜素含量呈现先上升后下降的趋势。发芽玉米籽粒 NaCl胁迫下类胡萝卜素含量的提高可能的原因是 NaCl胁迫导致玉米籽粒膜脂过氧化，而类胡萝卜素被认为是保护种子免受氧化应激的抗氧化剂[26]，可维持细胞内的氧化还原势，在抵御 NaCl胁迫时发挥重要作用，保障细胞正常生理活动。
2.3 NaCl胁迫下发芽玉米籽粒中抗氧化活性的变化
2.3.1 SOD和POD活性变化
发芽玉米籽粒在0～300 mmol/L的NaCl处理下，随着NaCl浓度增加，其SOD活性逐步提高。在300 mmol/L NaCl处理下，SOD 活性增加显著（p＜0.05），比对照提高了 30.79%。当 NaCl浓度增加到 600 mmol/L时，SOD活力相比与300 mmol/L组略有下降，但无显著性差异（p＜0.05）（图 4a），表明 NaCl处理对发芽玉米籽粒中 SOD活性具有一定的促进作用。在0～600 mmol/L浓度范围内，NaCl胁迫发芽玉米籽粒中 POD活性变化随处理浓度的增加呈上升趋势。600 mmol/L NaCl胁迫的发芽玉米籽粒中POD活性达到最大值783.59 U/g，比对照组增加了23.57%（图4b）。上述结果与樊丽[27]研究草莓叶片在NaCl胁迫条件下，其SOD和POD活性增加的结果类似。
图4 不同浓度NaCl胁迫下发芽玉米籽粒中SOD和POD活性
Fig.4 SOD and POD activity of germinated corn kernels under different concentrations of NaCl
注：不同小写字母表示各处理组间差异显著（p＜0.05）。下图同。
SOD是植物自由基清除系统中重要的保护酶之一，可以消除超氧化物阴离子自由基生成 H2O2；而POD是植物清除过氧化物、降低活性氧伤害的另一种关键酶，可将H2O2分解成H2O和O2，降低H2O2浓度从而降低毒害作用[13]。发芽玉米籽粒在 NaCl胁迫下产生活性氧，导致膜脂过氧化，此时植物组织启动其保护酶系统以降低或消除活性氧的损害。根据试验结果可知NaCl胁迫下，发芽玉米籽粒中SOD和POD活性均增强，可有效清除膜脂过氧化物对其造成的生理伤害[28]，维持其健康生长和正常的生理功能。
2.3.2 抗氧化能力指数(ORAC)变化
发芽玉米籽粒NaCl胁迫对ORAC值具有显著的影响。随NaCl浓度增加，玉米籽粒发芽第3 d的ORAC值先上升后下降（图5），该趋势与盐胁迫下玉米籽粒中类胡萝卜素含量变化趋势类似。NaCl浓度从0升高至300 mmol/L时，ORAC值显著提高（p＜0.05），在300 mmol/L 时达到最大值（173.14 μmol Trolox/g），是对照的4.74倍。随后NaCl浓度升高，ORAC值显著下降。用NaCl溶液处理草莓果实后发现，低浓度NaCl处理组的ORAC值是对照组的1.11倍，随着NaCl浓度上升，草莓果实中ORAC值呈现先升高后下降的趋势[28]。
图5 不同浓度NaCl胁迫下发芽玉米籽粒ORAC值
Fig.5 The ORAC values of germinated corn kernels under different concentrations of NaCl
NaCl胁迫下发芽玉米籽粒中总抗氧化能力显著增强，为抵御 NaCl胁迫对发芽玉米籽粒造成的活性氧损伤，机体一方面通过调节细胞内抗氧化酶 SOD和 POD活性来清除细胞内的活性氧，另一方面提高类胡萝卜素在玉米籽粒体内合成积累，从而清除NaCl胁迫产生的活性氧和有害自由基，这与本研究中SOD、POD活性、ORAC值增加和类胡萝卜素含量升高的结果相对应。金兰[29]等人研究发现，不同浓度NaCl胁迫下紫花苜蓿中SOD和POD活性随盐浓度增大而增强，但较高浓度下SOD活性减弱。NaCl胁迫下玉米籽粒的总抗氧化能力增强，提高了其抗逆性，有利于芽苗生长及营养积累。
2.4 类胡萝卜素合成途径中关键酶基因的相对表达量变化
外源施加不同浓度的 NaCl对类胡萝卜素合成途径中关键酶基因相对表达量的影响如图 6所示。在0～300 mmol/L NaCl处理下，PSY、PDS 和ZDS 基因相对表达量均随NaCl浓度增大而增加（图6a、b、c），当NaCl浓度为300 mmol/L时，以上3种基因表达量显著提高，分别是对照的1.63、1.53和1.31倍，加快了类胡萝卜素合成速率。在450和600 mmol/L NaCl处理下，3种关键酶基因相对表达量均降低，类胡萝卜素合成速率减慢。PSY基因与高盐、干旱、高光等非生物胁迫有关，可应答非生物胁迫并进行自身调节，参与植物的抗逆反应[30]。尤丽佳[31]等人研究发现用300 mmol/L NaCl处理过表达PSY基因的拟南芥，其类胡萝卜素含量是对照的2.91倍。但高浓度NaCl会抑制类胡萝卜素合成途径中关键酶的相对表达量，从而降低类胡萝卜素含量。PSY是类胡萝卜素合成途径中的第一个合成酶，也是限速酶，其活性和相对表达量直接影响合成效率。研究表明，在土豆中过表达PSY基因可显著提高类胡萝卜素水平，油菜种子过表达PSY基因可使其类胡萝卜素增加50倍[32]。此外，PDS和 ZDS共同参与完成类胡萝卜素合成途径中的去饱和反应生成番茄红素，同是合成途径中的限速酶。
图6 NaCl处理下发芽玉米籽粒中类胡萝卜素合成途径关键酶基因的相对表达量变化
Fig.6 Relative expression changes of key enzyme genes in carotenoid synthesis pathway in germinated corn kernels under NaCl treatment
如图 6d 所示，在 300 mmol/L NaCl处理下，LCYB基因相对表达量与对照无显著变化，随 NaCl浓度增加，其相对表达量显著下降，分别比对照减少了33.77%和49.85%。NaCl浓度在0～600 mmol/L范围内，LCYE、BCH1和CYP97C基因相对表达量均随浓度增加呈现先增高后降低的趋势，且 NaCl浓度为 300 mmol/L时，三者相对表达量显著增加，分别为对照的1.87、1.76和 1.45倍（图 6e、f、g）。目前研究表明LCYB和LCYE酶将类胡萝卜素路径分为两个支路，番茄红素经LCYB和LCYE共同催化生成α-胡萝卜素，再经BCH1和CYP97C催化最终生成叶黄素；另一支路由LCYB催化生成β-胡萝卜素，再经胡萝卜素BCH1催化，最终转化为玉米黄质[6]。本研究结果显示，300 mmol/L NaCl处理下 LCYB 基因相对表达量无显著变化，而LCYE基因相对表达量显著提高，表明番茄红素流向 α-胡萝卜素分支途径。同时 BCH1和CYP97C基因相对表达量也显著提高，进一步促进α-胡萝卜素合成叶黄素，从而玉米籽粒中的叶黄素得到富集。同样在LCYE基因过量表达的拟南芥中，检测到叶黄素的含量是野生型的2倍[33]。此外，BCH1相对表达量的增加也促进了玉米黄质的合成，且LCYB基因表达量无显著增加，番茄红素下游途径流向α-胡萝卜素，因此，发芽玉米籽粒中玉米黄质含量低于叶黄素含量。在Li[34]的研究中，玉米籽粒中高LCYE相对表达量对应较高的类胡萝卜素（尤其是叶黄素和玉米黄质组分）的积累量，随玉米籽粒发育 10～30 d，其叶黄素和玉米黄质含量分别增加了19.9和9.6倍。当 NaCl浓度继续增加时，类胡萝卜素合成途径中关键酶基因相对表达量均显著下降，表明 NaCl浓度大于300 mmol/L时，酶基因表达受到抑制，降低类胡萝卜素合成速率，从而类胡萝卜素含量下降。
3 结论
本研究探讨了 NaCl胁迫发芽玉米籽粒富集类胡萝卜素的条件，得出300 mmol/L NaCl胁迫下，发芽玉米籽粒中限速酶PSY、PDS、ZDS基因表达量显著提高，加快类胡萝卜素合成速率。叶黄素合成分支途径中关键酶LCYE、CYP97C基因相对表达量分别比对照提高了1.87和1.45倍，促进了叶黄素的合成，其含量最高达 13.18 μg/g，其次玉米黄质含量为 7.89 μg/g，二者分别为对照的1.19和1.30倍。此外，玉米籽粒的SOD、POD及总抗氧化能力ORAC显著升高，提高了发芽玉米籽粒的抗氧化活性。综上所述，300 mmol/L NaCl胁迫下发芽玉米籽粒可作为一种富含类胡萝卜素功能性食品的来源，为玉米产品的深加工及综合利用提供科学依据和新思路。
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